Perbandingan Spesifitas dan Kesensitifan Teknik Imunokimia dengan Teknik Molekuler dalam Pendeteksian Erwinia amylovora

Saturday, January 16, 2010

PENDAHULUAN

Erwinia amylovora (Winslow dkk 1920), yang menyebabkan penyakit hawar api (fire blight) pada tanaman, tercakup diantara organisme karantina di banyak negara di seluruh dunia dimana tindakan karantina terbatas digunakan. Hawar api kemungkinan merupakan penyakit paling serius yang mengenai buah dan tanaman hias dalam famili Rosaceae. Host yang penting secara ekonomi mencakup Pyrus spp., Malus spp., Cydonia spp., Crataegus spp., Cotoneaster spp., Sorbus spp. dan lainnya. Tindakan-tindakan penatalaksanaan mencakup survei tanaman yang diduga mengalami penyakit, uji laboratorium, pemberantasan tanaman terinfeksi, dan pengendalian tentang material tanaman propagatif dan terolah. Patogen ini bisa bertahan hidup sebagai endofita atau epifita untuk periode waktu yang berbda-beda tergantung pada faktor-faktor lingkungan.

   
Sebuah tahapan penting dalam pengendalian penyakit ini tergantung pada pendeteksian patogen secara cepat dan spesifik. Saat ini, beberapa dari metode yang paling sering digunakan untuk mengidentifikasi Erwinia amylovora didasarkan pada serologi, diantaranya uji aglutinasi slide (SA), berbagai tipe ELISA, dan immunofluoresensi (IF).
   
Keberhasilan dari masing-masing metode ini tergantung pada tipe antibodi spesifik. Penggunaan antibodi poliklonal memungkinkan pendeteksian spektrum turunan patogen yang lebih luas.
   
Uji SA (slide agglutination) merupakan sebuah uji yang cepat dan murah yang biasanya relatif dapat diandalkan. Meski demikian, reaksi-silang dengan bakteri seperti Pseudomonas syringae, Pantoea agglomerans dan P. dispersa terkadang diamati. Uji tambahan direkomendasikan untuk pengidentifikasian yang tepat. Kekurangan dari uji SA adalah persyaratan kultur murni untuk pengujian.
   
Uji ELISA dan immunofluoresensi sangat cocok untuk screening rutin terhadap banyak sampel yang diambil secara langsung dari jaringan tanaman. Evaluasi sangat cepat dan hasilnya akurat ketika antibodi yang sangat spesifik digunakan untuk evaluasi bentuk dan ukuran sel bakteri. Secara umum, kesensitifan ELISA tidak langsung yang cukup rendah merupakan kekurangan utama dalam pendeteksian patogen bakteri secara rutin.
   
Salah satu teknik yang menarik untuk pendeteksian Erwinia amylovora, yang juga menggunakan antibodi monoklonal, adalah IP-ELISA. Metode ini bergantung pada penggunaan membran nitroselulosa untuk mengimobilisasi material tanaman yang diambil untuk pengujian. IP-ELISA bisa mempermudah diagnosis putatif terhadap material tanaman simptomatik tetapi memerlukan konfirmasi lebih lanjut karena masalah-masalah spesifitas.
   
Metode-metode diagnostik klasik, yang didasarkan pada penggunaan media selektif atau semiselektif tidak bisa mendeteksi jumlah Erwinia amylovora yang kecil, karena pendeteksian tidak berkorelasi dengan gejala penyakit yang tampak. Pengkulturan bisa gagal karena kompetisi atau inhibisi oleh bakteri saprofita.
   
Teknik hibridisasi DNA dikembangkan dengan DNA dari plasmid 29-kb yang umum bagi turunan Erwinia mylovora. Patogen FB dengan demikian bisa dideteksi melalui hibridisasi koloni dengan DNA plasmid atau dengan fragmen-fragmennya yang dikloning sebagai probe. Metode-metode molekuler yang baru seperti PCR real-time dan PFGE dan lainnya digunakan untuk analisis Erwinia amylovora secara rinci, tetapi metode-metode tersebut belum tersedia untuk pengujian rutin.
   
Pengidentifikasian turunan E. amylovora secara biokimia biasanya dilakukan dengan analisis asam lemak menggunakan kromatografi gas dan/atau menggunakan sistem identifikasi mikroba (BIOLOG Bacteria) yang didasarkan pada spektrum reaksi pemanfaatan karbon.
   
Tujuan dari penelitian kali ini adalah untuk membandingkan keandalan antibodi poliklonal yang tersedia untuk uji ELISA dan IF, dan PCR dengan primer-primer yang dilaporkan oleh Bereswill dkk (1995) dan yang dikembangkan dalam laboratorium kami untuk pendeteksian dan pengidentifikasian Erwinia amylovora.

Bahan dan Metode
   
Pendeteksian dan penentuan bakteri FB dilakukan dengan uji agglutinasi slide (SA), uji immunosorbent terkait enzim-antigen yang terjebak plat (PTA-ELISA), turunan antibodi fluoresensi tidak langsung (IFAS), dan reaksi rantai polimerase (PCR).
   
Turunan bakteri. Isolat-isolat Erwinia amylovora yang berasal dari sampel tanaman berbeda dengan gejala hawar api yang tipikal dan atipikal, dianalisis. Turunan-turunan bakteri diambil dari jaringan-jaringan yang terinfeksi, ditumbuhkan pada agar pepton daging (MPA) dan diinkubasi pada suhu 25oC. Identitas semua turunan E. amylovora dikonfirmasi menggunakan Sistem BIOLOG GN MicroPlate dan uji buah pir tidak matang.
   
PTA-ELISA dan IFAS. Antibodi poliklonal komersial digunakan untuk diagnosis bakteri FB pada uji-uji immunokimia berdasarkan rekomendasi-rekomendasi pabrik yang membuat. Pada kedua tes, antibodi poliklonal kelinci yang meningkat pada seluruh sel turunan E. amylovora Eropa tipikal digunakan. Antibodi ini digunakan sebagai konyugasi anti IgG-AP kelinci pada PTA-ELISA dan anti FITC kelinci untuk IFAS. Antibodi yang diencerkan tidak digunakan karena ini melibatkan risiko hasil false-negative dengan beberapa turunan E. amylovora.
   
Persiapan sampel bakteri dan pengisolasian DNA untuk PCR. Apabila kultur bakteri murni digunakan, suspensi bakteri disesuaikan secara spektrokimia menjadi sekitar 108 CFU/mL dan selanjutnya diencerkan menjadi 104 CFU/mL. Satu µL dari masing-masing pengenceran suspensi bakteri ditambahkan secara langsung ke dalam bauran reaksi PCR. Ketika sampel tanaman yang terinfeksi digunakan, diperlukan untuk menggunakan Ndeasy Plant Mini Kit. Pengisolasian DNA dilakukan menurut protokol pabrik untuk masing-masing pengenceran sampel tanaman terinfeksi yang telah dihomogenisasi.
   
PCR dan elektroforesis gel. PCR dilakukan dengan sebuah Mini Cycler. Primer EaF72 5'-CGT GAC GCT GGA TGA AAT GC-3' dan EaR560 5'-CTC CCG CAT CCA GTC AAG TG-3' yang dirancang dalam laboratorium kami untuk pendeteksian dan penentuan E. amylovora disintesis dengan Generi Biotech. Produk PCR teramplifikasi (3 µL) dicampur dengan 2 µL buffer yang mengandung turunan Sybr Green dan dijalankan pada gel Agarosa 1%.

HASIL DAN PEMBAHASAN
   
Dalam eksperimen kami dimana antibodi poliklonal dari Neogen Europe digunakan, PTA-ELISA cukup sensitif pada nilai 105 CFU/mL, sedangkan IFAS mampu mendeteksi E. amylovora pada 104 CFU/mL untuk beberapa turunan bakteri. Hitschemackers dkk (1990) melaporkan hasil yang mirip, dengan IF yang menunjukkan batas pendeteksian 104 CFU/mL. Zielke dkk. (1993) melakukan uji IF dan DAS-ELISA untuk pendeteksian E. amylovora dimana antibodi poliklonal digunakan. E. amylovora dideteksi pada 105 CFU/mL.
   
Kesensitifan PCR (primer EaF72 dan EaR560) adalah < 104 CFU/mL untuk beberapa turunan (Gbr. 1). Momol dkk. (1998) menemukan bahwa plating langsung pada mdium MMS dan pengayaan yang diikuti dengan PCR hampir sama sensitifnya dalam mendeteksi E. amylovora, batas pendeteksian sekitar 150 sel per sampel jaringan atau 30 sel per mL. Primer-primer pEA17 mampu mendeteksi 10 CFU E. amylovora dalam campuran PCR. Untuk pendeteksian E. amylovora dengan PCR secara langsung dari jaringan tanaman, sebuah metode cepat dikembangkan.
   
Dari 80 sampel tanaman host yang memiliki gejala penyakit hawar api, E. amylovora diisolasi dengan plating pengenceran pada 63 kasus dan diidentifikasi sebagai E. amylovora secara meyakinkan dengan menggunakan metode SA, PTA-ELISA, IFAS, dan PCR. Ketika menganalisis sampel-sampel asimptomatik, korelasi tinggi diharapkan ditemukan antara isolasi dan hasil uji serologi dan molekuler. Pengisolasian E. amylovora dari sampel-sampel simptomatik relatif mudah karena jumlah bakteri yang dapat dikulturkan di dalamnya biasanya tinggi. Akan tetapi, apabila gejala-gejala yang ada sangat parah atau ketika kondisi lingkungan tidak mendukung untuk kenampakan hawar api, maka jumlah sel E. amylovora yang dapat dikulturkan kemungkinan sangat rendah. Lebih lanjut, jika plat-plat terlalu padat atau bakteri antagonis diduga, maka pengisolasian E. amylovora akan semakin sulit.
   
Ketika antibodi poliklonal dari Neogen Europe dan IFAS digunakan, ada 14% reaksi silang dibanding 20% pada PTA-ELISA. Dengan menggunakan teknik PCR, Bereswill dkk. (1995) menemukan 2,5% hasil false-positive tetapi kesalahan ini bisa dihilangkan jika digunakan tindakan-tindakan pengoptimalan.
   
Berbagai enterobakteri ditemukan terkait dengan E. amylovora pada beberapa sampel. Setelah optimisasi protokol PCR, tidak ada turunan yang diidentifikasi sebagai E. amylovora. Dengan menggunakan sistem BIOLOG Bacteria, turunan-turunan ini diidentifikasi sebagai Pantoe agglomerans, P. dispersa, Enterobacter cloaceae, E. gergoviae, Rahnella aqualitis dan Klebsiella pneumoniae.
   
Antibodi poliklonal kelinci EA 54 yang dihasilkan dari antigen sel digunakan dalam uji SA. Delapan reaksi silang diamati tetapi pada 5 kasus reaksi ini sangat lemah. Semua isolat yang bereaksi silang mudah dibedakan pada medium MPA karena morfologi berkoloni agak berebda dari isolat E. amylovora yang tipikal. IFAS tidak hanya lebih sensitif tetapi juga lebih spesifik dibanding PTA-ELISA. Apabila IFAS digunakan, lebih sedikit reaksi-silang yang ditemukan berbeda dengan PTA-ELISA.
   
Pada 36 sampel tanaman simptomatik yang diuji, IFAS tampak sangat sensitif untuk pendeteksian E. amylovora dari sampel-sampel tanaman (khususnya pada pengenceran yang lebih rendah) karena E. amylovora dideteksi pada 100 sampai 89% sampel dengan pengenceran 1:100 dan 1:1000, masing-masing. Pada pengenceran yang lebih rendah, pengamatan slide IF sulit karena jaringan tertinggal dalam medan sumur slide. Dengan PTA-ELISA, E. amylovora lebih dapat dideteksi pada pengenceran 1:10 (94%), akan tetapi, pada pengenceran 1:100, pendeteksian cukup rendah (42%).
   
Biaya untuk mengolah dan diagnosis sampel tanaman yang diduga mengandung E. amylovora cukup sebanding antara PTA-ELISA dan IFAS. Akan tetapi, IFAS lebih cocok dibanding PTA-ELISA untuk menghilangkan hasil false positive karena mempermudah evaluasi bentuk dan ukuran sel-sel bakteri.
   
Kesensitifan PCR tampaknya sangat rendah karena E. amylovora tidak dideteksi pada konsentrasi <109 CFU/mL. Ini bisa disebabkan oleh tidak cocoknya metode pengisolasian DNA dari sel-sel bakteri. Ini bisa disebabkan oleh kecilnya jumlah DNA target dalam sampel, meski juga disebabkan oleh inhibisi PCR yang disebabkan oleh senyawa-senyawa yang dilepaskan dari sel-sel tanaman yang rusak.
   
Kami menggunakan primer AMSbL dan AMSbR dalam PCR menurut Bereswill dkk. (1995) dan menemukan bahwa kemampuan pendeteksian E. amylovora bisa ditingkatkan menggunakan teknik PCR teroptimasi menurut Bereswill dkk. (1995), melalui penghilangan hasil false-positive. PCR juga jauh lebih spesifik dibanding teknik imunokimia, PTA-ELISA dan IFAS, apabila primer kami gunakan (EaF72, EaR560) yang ditujukan untuk pendeteksian E. amylovora, digunakan, karena tidak ada hasil false positive yang ditemukan. Hasil yang diperoleh cukup mirip apabila kesensitifan PCR teroptimasi menurut Bereswill dkk. dan PCR dengan primer EaF72 dan EaR560 dibanding dengan seri pengenceran kultur E. amylovora murni.
   
Dengan metode-metode imunokimia, seperti SA, ELISA, dan IFAS, keterpercayaan hasil yang diperoleh tergantung pada kualitas antibodi yang digunakan. Berdasarkan hasil yang diperoleh, antibodi poliklonal komersial untuk pendeteksian E. amylovora tidak cukup dapat diandalkan. Kami tidak memiliki antibodi monoklonal yang diharapkan menunjukkan spesifitas lebih tinggi. Dengan demikian, kami berfokus pada teknik PCR Bereswill dkk. (1995), pada PCR teroptimasi dan juga pada PCR yang memiliki primer EaF72 dan EaR560 spesifik. Jika antibodi poliklonal digunakan untuk uji screening imunokimia pertama, kami merekomendasikan agar selalu dikombinasi dengan PCR, atau dengan PCR teroptimasi. Penggunaan lebih dari satu uji screening berdasarkan prinsip-prinsip biologis yang berbeda direkomendasikan untuk diagnosis FB. Jika hasil positif diperoleh dalam uji screening, tetapi uji isolasi negatif, maka isolasi harus diulangi. Hasil negatif tidak selamanya menjamin tidak adanya patogen. Pengidentifikasian kultur isolat E. amylovora murni secara terpercaya dicapai dengan menggunakan uji-uji patogenisitas pada tanaman-tanaman host untuk agen hawar api.

0 comments:

Post a Comment

BlueDEX Ads
 
Bloggerized by Blogger Template