Penentuan dimetilarginin asimetri (ADMA) menggunakan uji ELISA terbaru
Pendahuluan
Dimetilarginin asimetri (ADMA) dan isomernya, dimetilarginin simetri (SDMA), dihasilkan melalui degradasi protein bergugus-metil sebagai akibat dari aktivitas protein arginin metiltransferase 1 (PRMT 1) dan turnover protein fisiologis selanjutnya. ADMA, merupakan inhibitor endogen untuk oksida nitrat sintase endotelium (eNOS). ADMA dihilangkan dari tubuh baik dengan eksresi ginjal atau dengan degradasi dimetilamin dan citrulin melalui enzim dimetilarginin dimetilaminohidrolase (DDAH). ADMA menghambat eNOS melalui penggantian substrat fisiologis secara kompetitif, L-arginin, dari enzim. Inhibisi ini mengarah pada penurunan produksi NO dalam endotelium dinding pembuluh. Sehingga, apabila kadar ADMA meningkat, disfungsi endotelium bisa terjadi.
Kadar ADMA plasma yang meningkat pertama kali dilaporkan pada pasien dengan gagal ginjal, sebuah penyakit yang terkait erat dengan disfungsi endotelium dan terkait dengan mortalitas kardiovaskular yang sangat tinggi. Sampai sekarang, kadar ADMA yang meningkat telah ditemukan pada banyak penyakit yang terkait dengan jalur L-arginin-NO endotelium terganggu, seperti atherosklerosis, hiperkolesterolemia, gagal ginjal kronis, diabetes melitus tipe 2, stroke, hiperhomosisteinemia, dan hipertensi. Disamping itu, ADMA baru-baru ini telah ditunjukkan sebagai faktor risiko untuk penyakit kardiovaskular. Demikian juga, dengan pemberian ADMA kepada subjek manusia yang sehat, gejala-gejala disfungsi endotelium, seperti perfusi ginjal terganggu, output kardiak berkurang, dan tekanan darah meningkat bisa dipicu.
Dengan mempertimbangkan peranan ADMA sebagai sebuah faktor risiko dalam penyakit kradiovaskular, semakin banyak yang berminat dalam mengukur kadar ADMA pada subjek manusia, hewan, dan kultur sel. Sejauh ini, kuantifikasi ADMA dengan analisis HPLC dilakukan dengan ekstraksi sampel menggunakan kolom penukar ion diikuti dengan derivasi o-phtaladehida (OPA) dan HPLC fase terbalik dengan pendeteksian fluoresensi. Metode ini telah dimodifikasi oleh beberapa peneliti dengan mempertimbangkan prosedur ekstraksi, reagen derivatisasi, atau kolom HPLC yang digunakan. Berbeda dari HPLC dengan pendeteksian flouoresensi, strategi-strategi analitik berbeda diterapkan, diantaranya elektroforesis kapiler, LC-MS, dan GC-MS. Semua metode ini memerlukan banyak tenaga dan tidak tersedia di banyak loaboratorium. Ini menyebabkan kami memilih metode yang mudah dan lebih cepat untuk analisis ADMA. Disini kami melaporkan pengembangan dan validasi sebuah uji ELISA untuk penentuan konsentrasi ADMA pada subjek manusia, hewan, dan supernatan kultur sel. Kinerja analitik dari ELISA yang baru dikembangkan ini dinilai dengan mengevaluasi spesifitasnya, kesensitifan analitisnya, presisi, keakuratan (recovery, linearitas), dan perbandingannya dengan LC-MS dan GC-MS.
Bahan dan Metode
Bahan kimiawi
Semua bahan kimia dibeli dari Sigma (Munich, Jerman), atau Merck (Darmstadt, Jerman).
Pereaksi
Plat-plat mikro-titer (96-wadah) yang terdiri dari strip-strip mikrotiter, masing-masing delapan wadah (Maxisorb; Nunc; Roskilde, Denmark) dilapisi dengan ADMA yang terikat ke albumin. Larutan standar A-F adalah larutan ADMA dengan konsentrasi: 0, 0,2, 0,3, 0,6, 1,0, dan 5,0 µmol/L. Larutan kontrol 1 dan 2 memiliki konsentrasi ADMA masing-masing 0,25-0,45µmol/L dan 0,6-1,0µmol/L. Sebuah larutan buffer asilasi (1 mol/L Tris-HCl, pH 9,1) disediakan, bersama dengan sebuah buffer penyesuaian (yang akan dilarutkan dalam air) dan sebuah reagen asilasi lyophilized (asam N-hidroksisuccinimido karbonat yang akan dilarutkan dalam 1,5 mL dimetilformamida). Antiserum anti-N-asil-ADMA kelinci digunakan untuk mendeteksi asil-ADMA, dan konyugat enzim merupakan sebuah IgG peroksidase anti-kelinci. Untuk menghasilkan imunogen untuk mengimunisasi kelinci, ADMA diikat ke asam succinat, dan selanjutnya diikat ke albumin serum bovin (BSA) dengan metode karbodiimida.
Konsentrat buffer penuci diencerkan 1:10 sebelum digunakan. Substrat untuk konyugat enzim adalah tetrametilbenzidin (TMB). Reaksi warna dihentikan dengan larutan penghenti 0.3M asam sulfit.
Semua reagen stabil selama sekurang-kurangnya 6 bulan jika disimpan pada suhu 2-8oC. Reagen-reagen yang dibuat stabil hingga sampai 24 jam pada 2-8oC.
Sampel
Sampel plasma dan serum diambil dari subjek manusia sehat. Supernatan (lapisan teratas) kultur sel (medium Eagle termodifikasi Dulbeco + 5% serum anak sapi) diambil dari eksperimen-eksperimen dalam laboratorium kami dengan sel-sel arteri koroner manusia (HAEC). Sampel mencit dan tikus berasal dari hewan-hewan sehat di laboratorium kami.
Serum kontrol yang berkualitas
Sampel kontrol dibuat dengan menambahkan larutan baku berbeda dengan konsentrasi ADMA diketahui ke dalam masing-masing sampel plasma yang berasal dari relawan normal atau hewan. Kontrol kemudian dipisah-pisahkan dan disimpan pada suhu -80oC.
Alat ELISA
Penanganan sampel. Serum atau plasma (yang diperoleh dengan menggunakan botol EDTA) bisa digunakan dalam alat ELISA. Sampel darah yang dihemolisis atau sampel darah lipemik tidak boleh digunakan dalam uji ini. Sampel bisa disimpan selama sampai 24 jam pada 2-8oC. Sampel yang tidak digunakan pada hari yang sama bisa disimpan pada suhu -20oC selama 12 bulan. Pembekuan dan pencairan berulang harus dihindari.
Pra-perlakuan sampel (asetilasi). Larutan standar A-F (20 µl), larutan kontrol 1 atau 2 (20 µl), dan 20 µl sampel dipipet ke dalam wadah plat reaksi 96-wadah. Buffer asilasi (25 µl) dan buffer penyesuaian (25 µl) ditambahkan ke masing-masing wadah. Plat reaksi dikocok selama 10 detik. Reagen asilasi yang baru dibuat (25 µl) ditambahkan dan dikocok dengan cepat. Plat reaksi diinkubasi selama 30 menit pada suhu kamar di sebuah pengocok horizontal (Titramax 101; Heidolph, Schwabach, Jerman). Buffer penyesuaian tambahan (1,5 ml) dicampur dengan air (9 ml) dan 100 µl campuran ditambahkan ke masing-masing wadah. Plat reaksi diinkubasi kembali selama 45 menit pada suhu kamar. Setelah tahapan ini sebuah bekuan mirip jel bisa terbentuk, tetapi ini tidak mempengaruhi kinerja uji. Alikuot (50 µl) dari larutan standar yang dibuat, kontrol dan sampel digunakan dalam uji ELISA.
Prosedur uji ELISA. Alikuot (50 µL) dari larutan standar pra-perlakuan, kontrol dan sampel dipipet ke dalam wadah plat mikro-titer dan larutan antiserum (50 µl) ditambahkan ke masing-masing wadah. Plat mikro-titer dikocok selama beberapa waktu pada pengocok horizontal dan plat ditutupi dengan foil adhesif. Plat diinkubasi selama 15-20 jam pada 2-8oC. Setelah inkubasi, larutan dari masing-masing wadah dihilangkan dan wadah-wadah dicuci dengan buffer pencuci (250 µl) sebanyak empat kali. Selanjutnya, larutan konyugat enzim (100 µL) ditambahkan ke masing-masing wadah dan plat mikro-titer diinkubasi selama 1 jam pada suhu kamar di sebuah pengocok horizontal. Kemudian wadah-wadah dicuci kembali empat kali dengan buffer pencuci. Setelah pencucian, larutan substrat (100 µl) dipipet ke dalam wadah-wadah dan plat diinkubasi selama 20-30 menit pada sebuah pengocok horizontal. Reaksi dihentikan dengan larutan penghenti dan kepadatan optik dibaca pada panjang gelombang 450 nm (panjang gelombang referensi 570-650 nm) dengan menggunakan pembaca plat mikro-titer (Sunrise; Tecan, Crailsheim, Jerman) dalam 1 jam.
Metode perbandingan
Kinerja uji ELISA dibandingkan dengan dua metode referensi kandidat yang baru-baru ini dikembangkan. ADMA dalam sampel serum manusia dan supernatan kultur sel ditentukan dengan ELISA dibandingkan dengan GC-MS. Metode GC-MS telah disebutkan sebelumnya.
Penentuan ADMA dalam sampel serum manusia dengan LC-tandem MS dilakukan dalam Laboratorium Kedokteran Bremen (MLHB, Jerman), sebuah laboratorium kedokteran komersial. Secara ringkas, analisis ini terdiri dari pemisahan HPLC fase-terbalik diikuti dengan pemantauan ion dengan spektrometri massa triple-quardopol API 4000 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA).
Metode statistik
Semua data dinyatakan sebagai nilai mean±SD. Perbandingan antara metode ELISA dan GC-MS atau MS tandem C dilakukan dengan regresi linear. Signifikansi statistik diterima untuk nilai p<0,05.
Dimetilarginin asimetri (ADMA) dan isomernya, dimetilarginin simetri (SDMA), dihasilkan melalui degradasi protein bergugus-metil sebagai akibat dari aktivitas protein arginin metiltransferase 1 (PRMT 1) dan turnover protein fisiologis selanjutnya. ADMA, merupakan inhibitor endogen untuk oksida nitrat sintase endotelium (eNOS). ADMA dihilangkan dari tubuh baik dengan eksresi ginjal atau dengan degradasi dimetilamin dan citrulin melalui enzim dimetilarginin dimetilaminohidrolase (DDAH). ADMA menghambat eNOS melalui penggantian substrat fisiologis secara kompetitif, L-arginin, dari enzim. Inhibisi ini mengarah pada penurunan produksi NO dalam endotelium dinding pembuluh. Sehingga, apabila kadar ADMA meningkat, disfungsi endotelium bisa terjadi.
Kadar ADMA plasma yang meningkat pertama kali dilaporkan pada pasien dengan gagal ginjal, sebuah penyakit yang terkait erat dengan disfungsi endotelium dan terkait dengan mortalitas kardiovaskular yang sangat tinggi. Sampai sekarang, kadar ADMA yang meningkat telah ditemukan pada banyak penyakit yang terkait dengan jalur L-arginin-NO endotelium terganggu, seperti atherosklerosis, hiperkolesterolemia, gagal ginjal kronis, diabetes melitus tipe 2, stroke, hiperhomosisteinemia, dan hipertensi. Disamping itu, ADMA baru-baru ini telah ditunjukkan sebagai faktor risiko untuk penyakit kardiovaskular. Demikian juga, dengan pemberian ADMA kepada subjek manusia yang sehat, gejala-gejala disfungsi endotelium, seperti perfusi ginjal terganggu, output kardiak berkurang, dan tekanan darah meningkat bisa dipicu.
Dengan mempertimbangkan peranan ADMA sebagai sebuah faktor risiko dalam penyakit kradiovaskular, semakin banyak yang berminat dalam mengukur kadar ADMA pada subjek manusia, hewan, dan kultur sel. Sejauh ini, kuantifikasi ADMA dengan analisis HPLC dilakukan dengan ekstraksi sampel menggunakan kolom penukar ion diikuti dengan derivasi o-phtaladehida (OPA) dan HPLC fase terbalik dengan pendeteksian fluoresensi. Metode ini telah dimodifikasi oleh beberapa peneliti dengan mempertimbangkan prosedur ekstraksi, reagen derivatisasi, atau kolom HPLC yang digunakan. Berbeda dari HPLC dengan pendeteksian flouoresensi, strategi-strategi analitik berbeda diterapkan, diantaranya elektroforesis kapiler, LC-MS, dan GC-MS. Semua metode ini memerlukan banyak tenaga dan tidak tersedia di banyak loaboratorium. Ini menyebabkan kami memilih metode yang mudah dan lebih cepat untuk analisis ADMA. Disini kami melaporkan pengembangan dan validasi sebuah uji ELISA untuk penentuan konsentrasi ADMA pada subjek manusia, hewan, dan supernatan kultur sel. Kinerja analitik dari ELISA yang baru dikembangkan ini dinilai dengan mengevaluasi spesifitasnya, kesensitifan analitisnya, presisi, keakuratan (recovery, linearitas), dan perbandingannya dengan LC-MS dan GC-MS.
Bahan dan Metode
Bahan kimiawi
Semua bahan kimia dibeli dari Sigma (Munich, Jerman), atau Merck (Darmstadt, Jerman).
Pereaksi
Plat-plat mikro-titer (96-wadah) yang terdiri dari strip-strip mikrotiter, masing-masing delapan wadah (Maxisorb; Nunc; Roskilde, Denmark) dilapisi dengan ADMA yang terikat ke albumin. Larutan standar A-F adalah larutan ADMA dengan konsentrasi: 0, 0,2, 0,3, 0,6, 1,0, dan 5,0 µmol/L. Larutan kontrol 1 dan 2 memiliki konsentrasi ADMA masing-masing 0,25-0,45µmol/L dan 0,6-1,0µmol/L. Sebuah larutan buffer asilasi (1 mol/L Tris-HCl, pH 9,1) disediakan, bersama dengan sebuah buffer penyesuaian (yang akan dilarutkan dalam air) dan sebuah reagen asilasi lyophilized (asam N-hidroksisuccinimido karbonat yang akan dilarutkan dalam 1,5 mL dimetilformamida). Antiserum anti-N-asil-ADMA kelinci digunakan untuk mendeteksi asil-ADMA, dan konyugat enzim merupakan sebuah IgG peroksidase anti-kelinci. Untuk menghasilkan imunogen untuk mengimunisasi kelinci, ADMA diikat ke asam succinat, dan selanjutnya diikat ke albumin serum bovin (BSA) dengan metode karbodiimida.
Konsentrat buffer penuci diencerkan 1:10 sebelum digunakan. Substrat untuk konyugat enzim adalah tetrametilbenzidin (TMB). Reaksi warna dihentikan dengan larutan penghenti 0.3M asam sulfit.
Semua reagen stabil selama sekurang-kurangnya 6 bulan jika disimpan pada suhu 2-8oC. Reagen-reagen yang dibuat stabil hingga sampai 24 jam pada 2-8oC.
Sampel
Sampel plasma dan serum diambil dari subjek manusia sehat. Supernatan (lapisan teratas) kultur sel (medium Eagle termodifikasi Dulbeco + 5% serum anak sapi) diambil dari eksperimen-eksperimen dalam laboratorium kami dengan sel-sel arteri koroner manusia (HAEC). Sampel mencit dan tikus berasal dari hewan-hewan sehat di laboratorium kami.
Serum kontrol yang berkualitas
Sampel kontrol dibuat dengan menambahkan larutan baku berbeda dengan konsentrasi ADMA diketahui ke dalam masing-masing sampel plasma yang berasal dari relawan normal atau hewan. Kontrol kemudian dipisah-pisahkan dan disimpan pada suhu -80oC.
Alat ELISA
Penanganan sampel. Serum atau plasma (yang diperoleh dengan menggunakan botol EDTA) bisa digunakan dalam alat ELISA. Sampel darah yang dihemolisis atau sampel darah lipemik tidak boleh digunakan dalam uji ini. Sampel bisa disimpan selama sampai 24 jam pada 2-8oC. Sampel yang tidak digunakan pada hari yang sama bisa disimpan pada suhu -20oC selama 12 bulan. Pembekuan dan pencairan berulang harus dihindari.
Pra-perlakuan sampel (asetilasi). Larutan standar A-F (20 µl), larutan kontrol 1 atau 2 (20 µl), dan 20 µl sampel dipipet ke dalam wadah plat reaksi 96-wadah. Buffer asilasi (25 µl) dan buffer penyesuaian (25 µl) ditambahkan ke masing-masing wadah. Plat reaksi dikocok selama 10 detik. Reagen asilasi yang baru dibuat (25 µl) ditambahkan dan dikocok dengan cepat. Plat reaksi diinkubasi selama 30 menit pada suhu kamar di sebuah pengocok horizontal (Titramax 101; Heidolph, Schwabach, Jerman). Buffer penyesuaian tambahan (1,5 ml) dicampur dengan air (9 ml) dan 100 µl campuran ditambahkan ke masing-masing wadah. Plat reaksi diinkubasi kembali selama 45 menit pada suhu kamar. Setelah tahapan ini sebuah bekuan mirip jel bisa terbentuk, tetapi ini tidak mempengaruhi kinerja uji. Alikuot (50 µl) dari larutan standar yang dibuat, kontrol dan sampel digunakan dalam uji ELISA.
Prosedur uji ELISA. Alikuot (50 µL) dari larutan standar pra-perlakuan, kontrol dan sampel dipipet ke dalam wadah plat mikro-titer dan larutan antiserum (50 µl) ditambahkan ke masing-masing wadah. Plat mikro-titer dikocok selama beberapa waktu pada pengocok horizontal dan plat ditutupi dengan foil adhesif. Plat diinkubasi selama 15-20 jam pada 2-8oC. Setelah inkubasi, larutan dari masing-masing wadah dihilangkan dan wadah-wadah dicuci dengan buffer pencuci (250 µl) sebanyak empat kali. Selanjutnya, larutan konyugat enzim (100 µL) ditambahkan ke masing-masing wadah dan plat mikro-titer diinkubasi selama 1 jam pada suhu kamar di sebuah pengocok horizontal. Kemudian wadah-wadah dicuci kembali empat kali dengan buffer pencuci. Setelah pencucian, larutan substrat (100 µl) dipipet ke dalam wadah-wadah dan plat diinkubasi selama 20-30 menit pada sebuah pengocok horizontal. Reaksi dihentikan dengan larutan penghenti dan kepadatan optik dibaca pada panjang gelombang 450 nm (panjang gelombang referensi 570-650 nm) dengan menggunakan pembaca plat mikro-titer (Sunrise; Tecan, Crailsheim, Jerman) dalam 1 jam.
Metode perbandingan
Kinerja uji ELISA dibandingkan dengan dua metode referensi kandidat yang baru-baru ini dikembangkan. ADMA dalam sampel serum manusia dan supernatan kultur sel ditentukan dengan ELISA dibandingkan dengan GC-MS. Metode GC-MS telah disebutkan sebelumnya.
Penentuan ADMA dalam sampel serum manusia dengan LC-tandem MS dilakukan dalam Laboratorium Kedokteran Bremen (MLHB, Jerman), sebuah laboratorium kedokteran komersial. Secara ringkas, analisis ini terdiri dari pemisahan HPLC fase-terbalik diikuti dengan pemantauan ion dengan spektrometri massa triple-quardopol API 4000 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA).
Metode statistik
Semua data dinyatakan sebagai nilai mean±SD. Perbandingan antara metode ELISA dan GC-MS atau MS tandem C dilakukan dengan regresi linear. Signifikansi statistik diterima untuk nilai p<0,05.
Comments
Post a Comment