Pemilahan Sel Teraktivasi Fluoresensi (FACS)

Pemilahan sel teraktivasi fluoresensi (FACS) merupakan sebuah tipe khusus dari sitometri. Metode ini memilah campuran heterogen yang terdiri dari sel-sel biologis ke dalam dua atau lebih wadah, satu sel pada satu waktu, berdasarkan karakteristik hamburan cahaya dan fluoresens spesifik dari masing-masing sel. Ini merupakan sebuah instrumen ilmiah yang bermanfaat karena dapat mencatat sinyal-sinyal fluoresens secara cepat, objektif, dan kuantitatif dari sel-sel individual serta pemisahan sel-sel yang diinginkan secara fisik. Singkatan FACS merupakan merek-dagang yang dimiliki oleh Beton Dickinson walaupun istilah ini digunakan dalam komunitas ilmiah sebagai sebuah istilah umum. Pemilah sel yang pertama ditemukan oleh Mack Fulwyler pada tahun 1965 dengan menggunakan prinsip volume Coulter, sebuah teknik yang relatif sulit digunakan untuk pemilahan/pemisahan.
Teknik ini dikembangkan oleh Len Herzenberg yang kemudian melahirkan istilah FACS. Herzenberg memenangkan penghargaan Kyoto Prize pada tahun 2006 karena karyanya ini dalam sitometri alir.
Suspensi sel dimasukkan dalam pusat sebuah arus cairan yang sempit dan mengalir cepat. Aliran ini ditata sedemikian rupa sehingga ada pemisahan yang luas antara sel-sel relatif terhadap diameternya. Sebuah mekanisme vibrasi digunakan untuk menyebabkan arus sel terpisah menjadi tetesan-tetesan. Sistem ini disesuaikan sehingga kecil kemungkinan ada lebih dari satu sel yang terdapat dalam sebuah tetesan. Tepat sebelum arus terpisah menjadi tetesan-tetesan, aliran melewati sebuah stasiun pengukur fluoresensi dimana karakter fluoresens yang diinginkan dari masing-masing sel diukur. Sebuah cincin bermuatan listrik ditempatkan tepat pada titik dimana arus pecah menjadi tetesan-tetesan. Sebuah muatan ditempatkan pada cincin berdasarkan pengukuran intensitas fluoresensi sebelumnya dan muatan berlawanan dijebak pada tetesan-tetesan ketika terpisah dari arus. Tetesan-tetesan bermuatan kemudian menetes melalui sebuah sistem defleksi elektrostatik yang membelokkan tetesan-tetesan ke dalam wadah berdasarkan muatannya. Pada beberapa sistem, muatan diaplikasikan secara langsung ke arus dan tetesan-tetesan yang terpisah dari arus memiliki muatan dengan tanda yang sama seperti arus. Arus kemudian kembali menjadi netral setelah tetesan terpisah darinya.

Label-label fluoresens

Label-label fluroesens yang bisa digunakan tergantung pada lampu atau laser yang digunakan untuk mengeksitasi fluorokrom dan tergantung pada detektor-detektor yang tersedia.

Laser argon biru (488 nm)

Ini merupakan laser berpendingin udara sehingga lebih murah. Laser ini paling umum tersedia pada mesin-mesin laser tunggal.

  • Hijau (biasanya berlabel FL1): FITC, GFP, CFSE, CFDA-SE

  • Oranye (biasanya FL2): PE

  • Saluran merah (FL3): PerCP, PE-Cy5, PE-Cy5,5, PI

  • Inframerah (FL4): PE-Cy7

Laser helium-kadmium (HeCd) ultra ungu (325 nm)

  • Ultra-ungu: Hidroksikumarin

  • Biru: Y66H, Hoechst 33342

  • Hijau: Y66F

Lampur (HBO) UV (366 nm) (biasanya digunakan untuk pekerjaan DNA)

  • Ungu: Indo-1

  • Biru: DAPI, Hoechst 33342, AMCA

  • Biru-hijau: MMB

Laser dioda ungu (405 nm)

  • Pacific Blue(R) (dibuat oleh BD)

  • AmCyan

Laser helium-neon (HeNe) hijau (543 nm)
Jarang digunakan karena warnanya sangat mendekati laser biru 488 nm yang digunakan kebanyakan mesin.

Laser helium-neon (HeNe) merah (633 nm) atau laser dioda merah (635 nm)

  • APC

  • APC-Cy7

  • Cy5

Parameter-parameter yang dapat diukur
Jumlah parameter yang dapat diukur cukup banyak dan terus bertambah.

  • volume dan kompleksitas morfologi sel

  • pigmen sel seperti klorofil atau fikoeritrin

  • DNA (analisis siklus sel, kinetika sel, proliferasi, dll.)

  • RNA

  • analisis kromosom dan pemilahan (konstruksi pustaka, cat kromosom)

  • produk-produk transgenik in vivo, khususnya protein fluoresens Hijau atau protein fluoresens terkait

  • antigen-antigen permukaan sel (penana CD [cluster of differentiation]

  • antigen-antigen intraseluler (berbagai sitokin, mediator sekunder, dll.)

  • antigen-antigen nuklear

  • aktivitas enzimatis

  • pH, kalsium terionkan intraseluler, magnesium, potensial membran

  • fluidisitas membran

  • apoptosis (kuantifikasi, pengukuran degradasi DNA, potensial membran mitokondria, perubahan permeabilitas, aktivitas caspase)

  • viabiitas sel

  • memantau elektropermeabilisasi sel

  • ledakan oksidatif

  • karakterisasi resistensi multi obat (MDR) pada sel-sel kanker

  • glutation

  • berbagai kombinasi (antigen DNA/permukaan dll.)

Aplikasi

Teknologi ini memiliki aplikasi dalam beberapa bidang, termasuk biologi molekuler, patologi, imunologi, biologi tanaman, dan biologi kelautan. Dalam bidang biologi molekuler teknologi ini secara khusus digunakan dengan antibodi-antibodi bertanda fluoresensi. Antibodi-antibodi spesifik ini terikat ke antigen-antigen pada sel-sel target dan membantu memberikan informasi tentang karakteristik spesifik sel yang sedang diteliti dalam sitometer. Teknologi ini juga memiliki pengaplikasian luas di bidang kedokteran (khususnya dalam transplantasi, hematologi, imunologi tumor, dan kemoterapi, genetika dan pemilahan sperma pada IVF). Dalam biologi kelautan, sifat-sifat auto-fluoresensi dari plankton fotosintetik bisa dimanfaatkan melaui sitometri alir untuk mengkarakterisasi kelimpahan dan struktur komunitas. Dalam rekayasa protein, sitometri alir digunakan bersama dengan penampil jamur dan penampil bakteri untuk mengidentifikasi varian-varian protein yang ditampilkan permukaan sel dengan sifat-sifat yang diinginkan.

Pemilahan Sel Teraktivasi Fluoresensi (FACS)

Pada organisme multiseluler, semua sel identik DNA-nya tetapi proteinnya sangat berbeda. Dengan demikian, akan sangat bermanfaat jika kita dapat memisahkan sel-sel yang berbeda secara fenotip satu sama lain. Disamping itu, akan sangat membantu jika kita mengetahui berapa banyak sel yang mengekspresikan protein yang diinginkan. Dan berapa banyak protein ini yang diekspresikan. Pemilahan Sel Teraktivasi Fluoresensi (FACS) merupakan sebuah metode yang dapat mencapai semua ini.

Prosesnya dimulai dengan memasukkan sel ke dalam labu kimia dan memaksa sel memasuki cerat (nozzle) kecil pada satu waktu (Gambar 1). Sel-sel mengalir ke bawah melalui cerat yang digetarkan dengan frekuensi optimal untuk menghasilkan tetesan-tetesan pada jarak yang tetap dari cerat (nozzle). Ketika sel mengalir ke bawah mengikuti aliran zat cair, sel-sel ini discan oleh sebuah laser (cahaya biru pada gambar 1). Beberapa sinar laser dihamburkan (kerucut merah yang keluar dari sel merah) oleh sel-sel dan ini digunakan untuk menghitung sel. Sinar yang dihamburkan ini juga bisa digunakan untuk mengukur ukuran sel.

Jika anda ingin memisahkan sebuah sub-poulasi sel, anda bisa melakukannya dengan menandai sel yang diinginkan dengan sebuah antibodi yang terkait dengan zat warna fluoresens. Antibodi terikat ke sebuah protein yang diekspresikan secara unik dalam sel-sel yang ingin anda pisahkan. Sinar laser mengeksitasi zat warna yang mengemisikan warna cahaya yang dideteksi oleh tabung fotomultiplier, atau detektor cahaya. Dengan mengumpulkan informasi dari cahaya (hamburan dan fluoresensi) sebuah komputer bisa menentukan sel mana yang harus dipisahkan dan dikumpulkan.

Tahap akhir adalah pemilahan sel yang dicapai dengan muatan listrik. Komputer menentukan bagaimana sel-sel dipilah sebelum tetesan terbentuk pada ujung aliran. Ketika tetesan terbentuk, sebuah muatan listrik dialokasikan ke aliran dan tetes yang baru terbentuk akan terbentuk dengan sebuah muatan. Tetesan yang bermuatan ini kemudian dibelokkan ke kiri atau ke kanan oleh elektroda-elektroda bermuatan dan diarahkan ke dalam tabung-tabung sampel yang sudah disiapkan. Tetesan-tetesan yang tidak mengandung sel diarahkan ke tabung pembuangan. Hasil akhirnya adalah tiga tabung dengan subpopulasi sel yang tersendiri. Jumlah sel dalam masing-masing tabung diketahui dan tingkat fluoresensi juga dicatat untuk masing-masing sel.

Menghitung Data FACS

Data FACS yang dikumpulkan dengan komputer bisa ditampilkan dengan dua cara berbeda. Yang ingin kita ketahui adalah berapa banyak sel dari masing-masing warna yang dipisahkan. Pada contoh pertama (Gambar 2), kita melihat intensitas fluoresensi hijau atau merah diplotkan terhadap sumbu-X dan jumlah dengan masing-masing level fluoresensi diplotkan terhadap sumbu-Y. Pada contoh ini, ada dua kali lebih banyak sel merah yang dipisahkan dibanding sel hijau atau sel yang tidak diberi label, tetapi level cahaya lebih besar dari sel hijau dibanding sel merah. Metode ini sangat baik jika semua sel berwarna hijau, merah, atau tidak berlabel dan tidak ada sel yang berwarna dua.

Pada gambar 3, kita melihat sebuah cara berbeda untuk menampilkan data yang sama. Sumbu-X memplotkan intensitas fluoresensi hijau sedangkan sumbu-Y memplotkan intensitas fluoresensi merah. Titik-titik hitam menunjukkan sel-sel individual dan kita tidak menghitung titik-titik tersebut tetapi kita hanya melihat kepadatan relatif titik pada masing-masing kuadran. Dari grafik ini, kita bisa melihat tidak ada sel yang berwarna dua (merah dan hijau) (kanan atas) dan banyak sel yang tidak berwarna (kiri bawah). Jumlah sel berwarna hijau (kanan bawah) hampir sama dengan jumlah sel tidak berwarna, tetapi jumlah sel berwarna merah (kiri atas) sekitar dua kali jumlah kedua kategori sel yang lain. Lagi-lagi, kita bisa melihat bahwa level fluoresensi lebih tinggi dalam sel-sel hijau dibanding sel-sel merah. Metode penggambaran data ini khususnya bermanfaat jika sel-sel telah bertanda merah dan hijau.

-

Gambar 3. Kuantifikasi data FACS. Grafik ini membandingkan jumlah sel yang diberi dua warna – merah (sumbu-Y) dan hijau (sumbu-X). Intensitas siar yang diemisikan meningkat sebagaimana ditunjukkan oleh tanda panah. Jumlah sel pada masing-masing intensitas ditunjukkan oleh jumlah titik dimana masing-masing titik mewakili satu sel. Grafik ini tidak berfungsi untuk lebih dari dua warna tetapi befungsi baik jika sel-sel individual bisa diberi tanda dengan kedua warna ini pada waktu yang sama.

Comments

Post a Comment

Popular posts from this blog

Cara Memutihkan Kulit Wajah

Cara memutihkan kulit - terakhir dari tips kecantikan dalam informasi ini adalah tips pemutih kulit, karen bagi sebagian orang, khususnya di Indonesia, kulit putih yang sering dikaitkan dengan kulit yang indah. Tentu saja, hal ini tidak berlaku di mana-mana, karena ada banyak orang yang percaya bahwa kulit cokela terlihat eksotis dari warna kulit lainnya. Nah, jika Anda adalah seseorang yang berpikir bahwa putih lebih baik dan berniat untuk membuat kulit lebih cerah, Anda tidak perlu khawatir, karena memiliki banyak metode yang dapat Anda lakukan untuk mendapatkan kulit putih. Tips berikut adalah beberapa cara yang putih secara alami yang dapat menghasilkan hasil jika dilakukan secara konsisten. Jelas, tingkat putihnya kulit yang dapat dicapai juga sangat tergantung pada warna dasar kulit. selain itu Anda bisa lihat artikel cara memutihkan gigi, jika perlu.
Read more

Relationship between glycemic index and weight loss

Image
The glycemic index and weight loss both are complementary. A person who knows he is losing weight need to understand the term of glycemic index. This is a term given as the parameter/indicator to know which foods that have a glycemic index of a person on the road to weight loss to take or not. Some food items increased blood sugar levels in the body instantly and in opposition to this, some do it gradually. Foods containing carbohydrates are classified into three types according to the index, glycemic ie low, medium and high. Foods are classified IG 0-100. 0-55 Food is said to be low GI, 56-69 are medium and above 70 are considered high GI foods.
Read more

Cheerleaders are associated with many diet disorders

Image
South Carolina . Cheerleader is commonly a team of pretty girls and with performance always be waited every time there's a sport event in school. But a recent study found that the cheerleaders are at risk in developing body image problem and diet disorders. This study was conducted on 136 cheerleaders of school. The risk of body image problem and diet disorders were affected by the need of cheerleader to have ideal posture and the demand to wear a specific uniform. To conduct this study, the investigators surveyed body weight of participants, because body weight and height of cheerleaders area always considered ideal. Participants were also asked about what they think the perception of coaches and parents about their body image. Looks like this is very worrying, because what participants think is not in accordance with the expectations of their coaches or parents.
Read more