Ekspresi Molekul Adhesi Sel pada Plasenta dan Sel Plasenta Mencit
Abstrak
Integrin dan molekul adhesi sel-1 (VCAM-1) diperlukan untuk perkembangan plasenta yang normal. Dalam penelitian ini, subunit integrin α4, αv, β1, dan β3, dan VCAM-1 diteliti untuk ekspresi pada unit-unit uteroplasenta (hari 6 dan 8 kehamilan) dan plasenta (hari 10, 12, 14, 16, dan 18 kehamilan) dengan metode RT-PCR dan protein (yang dideteksi dengan imunofluoresensi) terdapat dalam semua jaringan selama kehamilan. VCAM-1 diekspresikan dengan intensitas kuat dalam ectoplacental cone dan sel-sel raksasa trofoblast, α4 diekspresikan kuat oleh sel-sel raksasa trofoblast dan diekspresikan sedang oleh spongiotrofoblast dan trofoblast labyrintin, dan αv diekspresikan lebih kuat dalam spongiotrofoblast dibanding dalam zona labyrintin. Β1 diekspresikan lebih kuat dalam labyrintin dibanding dalam zona spongiotrofoblast, sedangkan β3 dan VCAM-1 secara esensial sama pada kedua zona. Sel-sel SM9-1 yang mirip trofoblast positif untuk semua molekul adhesi saat diuji dengan RT-PCR dan imunositokimia. Ekspresi molekul adhesi pada sel-sel SM9-1 konsisten dengan ekspresi dalam zona labyrinthin. Secara kolektif, hasil dari penelitian ini menunjukkan bahwa plasenta mencit mengandung mRNA dan protein untuk α4, αv, β1, β3, dan VCAM-1, dan sehingga ekspresi yang terjadi spesifik sel. Hasil ini dan pengidentifikasian sel trofoblastis yang mengekspresikan molekul adhesi akan mempermudah penelitian di masa mendatang tentang fungsi molekul adhesi dalam perkembangan plasenta.
PENDAHULUAN
Famili integrin dari jenis glikoprotein diekspresikan dalam uterus semua spesies yang telah diteliti sampai sekarang ini. Pola-pola ekspresi integrin terkait dengan perkembangan blastosist, implantasi, dan perkembangan plasenta tanpa tergantung pada tipe plasentasi. Protein-protein heterodimerik yang dependen kation ini, yang terdiri dari sub-sub unit α dan β, berpartisipasi dalam adhesi sel-dengan-sel dan sel-dengan-substrat. Sekurang-kurangnya 23 kombinasi heterodimer diketahui terbentuk dari 17 subunit α dan 8 subunit β yang telah diidentifikasi sekarang ini. Spesifitas ligan dari heterodimer integrin ditentukan oleh kombinasi subunit α dan β.
Pola-pola ekspresi yang bervariasi dari sub-sub unit integrin tertentu dalam uterus mencit selama siklus reproduktif dan kehamilan menunjukkan bahwa protein-protein ini terlibat langsung dalam proses implantasi dan pembentukan plasenta normal serta fungsinya. Regulasi ekspresi sub-sub unit ini selama masa perkembangan dalam blastosist mencit juga konsisten dengan keterlibatan potensial dalam implantasi. Integrin berpartisipasi dalam beberapa fungsi yang diperlukan untuk plasentasi, termasuk adhesi sel, migrasi, dan invasi. Disamping itu, integrin terlibat dalam pensinyalan dua arah. Integrin diaktivasi atau mungkinan diaktivasi sebagai respons terhadap sebuah agonis atau perubahan tatanan sitoskeletan (pensinyalan dari dalam keluar) dan, ketika terikat ke sebuah ligan, bisa menginduksi berbagai peristiwa intraseluler yang bisa mengarah pada perubahan migrasi sel dan aktivasi gen (pensinyalan dari luar kedalam). Sehingga, integrin menarik sebagai partisipan potensial dalam kejadian-kejadian kompleks implantasi dan plasentasi.
Beberapa subunit integrin (α1, α2, α4-α7, β1, dan β3) telah diidentifikasi dalam sel-sel trofoblast normal embrio mencit sebelum dan selama implantasi, dan tampak bahwa ekspresi normal oleh subunit integrin α4, αv, dan β1 bisa terkait dengan kegagalan implantasi dan perkembangan plasenta abnormal. Pada mencit yang tidak mengandung subunit integrin α4, membran chorionik dan allantoik gagal bergabung, dan janin mati pada atau di sekitar hari 9 kehamilan. Gangguan-gangguan serupa terjadi pada penggabungan membran choriallantoik pada mencit yang kekurangan molekul adhesi sel vaskuler (VACM-1). VCAM-1 merupakan reseptor balik untuk α4β1. Mencit yang membawa mutasi dalam subunit integrin αv menunjukkan kelainan-kelainan pembentukan pembuluh darah yang menghasilkan pendarahan vaskular. Walaupun banyak mencit yang tidak mengandung subunit integrin αv mati segera setelah lahir, namun beberapa mati selama kehamilan, sehingga menandakan abnormalitas plasenta yang mungkin. Mencit dengan penghapusan tertargetkan pada subunit integrin β1, yang terikat ke 11 subunit α berbeda, mati selama tahap pra-implantasi sebagai akibat dari kegagalan massal sel innder.
Walaupun protein-protein yang terikat membran telah ditentukan penting untuk pembentukan plasenta yang baik dalam mencit dengan teknologi knock-out, namun pola-pola ekspresinya dalam plasenta sebagai sebuah fungsi kehamilan belum diketahui dengan baik. Dengan demikian, pada penelitian kali ini, analisis RT-PCR dan imunohistokimia digunakan untuk mengidentifikasi ekspresi spasial dan temporal sub-sub unit integrin (α4, αv, β1, dan β3) dan protein VCAM-1 dan mRNA dalam plasenta mencit. Disamping itu, sebuah kumpulan sel yang diambil dari plasenta mencit Siwss-Webster pada hari 9 kehamilan dengan menggunakan teknik imunohistokimia dan RT-PCR utnuk menentukan potensinya dalam penggunaan sebagai model in vitro untuk meneliti regulasi dan fungsi molekul-molekul adhesi trofoblast.
BAHAN DAN METODE
Mencit dan Pengambilan Sampel Jaringan
Sekelompok mencit Swiss-Webster dipeliharan sesuai dengan panduan-panduan dari Aminal Use and Care Committee Universitas Kansas Medical Center yang menyuplai jaringan yang digunakan untuk penelitian ini. Uterus dikumpulkan dari mencit-mencit hamil (keberadaan plug vaginal menandakan hari 1 kehamilan) pada hari 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 kehamilan (3 mencit/hari kehamilan). Untuk mikroskopi imunofluoresensi, unit-0unit uteroplasenta (jaringan embrionik dan uteroplasenta) diiris melintang dan dibekukan dalam senaywa OCT pada uap nitrogen cair dan disimpan pada suhu -80oC. Disamping itu, sampel-sampel plasenta dibekukan kilat dalam nitrogen cair dan disimpan pada suhu -80oC untuk analisis dengan RT-PCR.
Kultur Sel
Sebuah kelompok sel yang diambil dari plasenta mencit Swiss-Wester pada hari 9 kehamilan (SM9-1) dengan menggunakan metode-metode yang telah disebutkan sebelumnya (keberadaan plug vaginal dipertimbangkan sebagai har kehamilan 0) ditumbuhkan dalam corong kultur jaringan 75 cm2 dalam RPMI 1640 yang mengandung antibiotik dan disuplementasi dengan serum janin bovine 10% dan 50 µM mercapto-etanol pada suhu 37oC, 5% CO2. Semua eksperimen dilakukan pada sel plasenta. Untuk pemeriksaan imunohistokimia, sel-sel SM9-1 ditumbuhkan pada Slide Chamber LabTek. Untuk analisis RT-PCR, sel-sel SM9-1 dari dua corong 75-cm2 sekitar 80% kerapatannya, dipanen dengan pengerukan sel dari corong, digumpalkan, dan dibekukan pada suhu -80oC untuk ekstraksi selanjutnya dengan mRNA poli(A)+.
Imunofluoresensi Tidak Langsung
Irisan-irisan tempat-tempat implantasi dan plasenta (ketebalan irisan antara 4 sampai 8 µm) dari tiga mencit berbeda per hari kehamilan (n = 3) diambil dengan menggunakan alat cryostat dan dipasang pada slide Superfrost berlapis Plus. Jaringan dan sel SM9-1 yang melekat ke Slide Chamber LabTek dicuci dalam PBS dan dibekukan dalam aseton -20oC selama 10 menit, dicuci dalam PBS dengan 0,3% Tween-20, dan diblokir dengan BSA 1% dan serum kambing 3% dalam PBS selama 30 menit pada suhu kamar. Irisan-irisan jaringan dan sel pada slide kaca selanjutnya diinkubasi dengan sebuah antibodi primer (Tabel 1) atau IgG kontrol yang cocok (kontrol negatif) selama 1 jam pada suhu 37oC. Setelah beberapa pencucian pada PBS yang mengandung 0,3% Tween-20, irisan-irisan jaringan dan sel-sel diinkubasi dengan sebuah antibodi kambing sekunder bergugus biotinil terhadap spesies host antibodi primer. Sampel-sampel diinkubasi dengan fluoresein-streptavidin selama 30 menit pada suhu kamar. Semua slide ditutupi dengan sebuah kaca dan medium yang mengandung gliserol-gelatin dengan 1% pehnol. Slide-slide diamati dengan menggunakan Nikon Axiophot2 yang dilengkapi dengan epifluoresensi, difoto, dan diberi skor oleh dua pengamat independen menggunakan sistem skoring staining negatif (-), lemah (±), sedang (+), atau kuat (++) seperti dijelaskan dalam literatur.
RT-PCR
mRNA poli(A)+ diisolasi dari sel-sel SM9-1 dan unit-unit uteroplasenta Swiss-Webster (hari kehamilan 6 dan 8) dan plasenta (hari kehamilan 10, 12, 14, 16, 18) dari tiga mencit berbeda per hari kehamilan (n = 3) dengan menggunakan alat isolasi mRNA. Terkecuali virus leukemia mencit (MuLV) transkriptase terbalik (mRT), bufer mRT, dan inhibitor RNasin ribonuklease (Rnase), yang dibeli dari Promega (Madison, WI), semua komponen prosedur ini dibeli dari perusahaan Perkin-Elmer. Analisis RT-PCR menggunakan primer-primer dan kondisi-kondisi yang sebelumnya telah disebutkan dalam ltieratur. Tabel 2 memberikan urutan-urutan primer dan kondisi-kndisi siklus. Sinyal gliseraldehida-3-fosfat dehidrogenase (G3PDH) mRNA digunakan sebagai kontrol pemuatan. Sebanyak 500 nanogram sampel di transkripsi balik dalam 20 µl campuran reaksi yang mengandung 5 mM MgCl2, 1 M masing-masing dari dATP, dCTP, dGTP, dan dTTP, 10 U/ml Rnasin, 10 U/m; mRT, 5 µM oligo dt(16), dan buffer (25oC, 10 menit; 42oC, 60 menit; 99oC, 5 menit; 5oC, 5 menit; Perkin-Elmer Model 1400 thermocycler). Reaksi RT diikuti dengan reaksi PCR yang dilakukan pada total volume 100 µl yang mengandung 2 mM MgCl2, bufer PCR kekuatan tunggal II, 2,5 U/100 µl polimerase DNA ApliTaq, dan 1 µM masing-masing dari primer 5' dan primer 3'. Produk-produk PCR dan penanda berat molekuler dipisahkan pada gel-gel agarosa 3% yang mengandung etidium bromida dan divisualisasikan dengan sinar ultraviolet.
HASIL
Unit-unit uteroplasenta (hari 6 dan 8 kehamilan) dan plasenta (hari 10, 12, 14, 16, dan 18) diperiksa untuk mengetahui ekspresi sub-sub unit integrin (α4, αv, β1, dan β3) dan protein VCAM-1. Hasilnya dirangkum pada Tabel 3.
Ekspresi Sub-sub unit integrin dan protein VCAM-1 dalam plasma
Pada seri eksperimen pertama, ekspresi subunit integrin α4, αv, β1 dan β3 dalam unit-unit uteroplasenta dan plasenta diamati dengan menggunakan imunofluresensi. Semua subunit integrin dan VCAM-1 menunjukkan pola-pola ekspresi spesifik yang berbeda sebagai sebuah fungsi tahapan kehamilan. Walaupun tujuan dari penelitian ini adalah untuk meneliti molekul-molekul adhesi dalam plasenta, staining dalam desidua juga dipertimbangkan.
Gambar 1A menunjukkan bahwa pada hari kehamilan 8, subunit integrin α4 diekspresikan dalam ectopalsental cone dan sel-sel raksasa trofoblast pada konseptus postimplantasi. Sel-sel raksasa trofoblast selama kehamilan menunjukkan pola ekspresi berbintik yang tampak berkolokalisasi pada permukaan membran plasma (Gbr. 1B). Dari hari kehamilan 10 sampai melahirkan, staining dideteksi pada semua zona plasenta. Zona spongioblast dan zona labyrintin serta plat chorionik dianggap intensif. Seperti ditunjukkan pada Gambar 1C, zona spngioblast memiliki pola staining berbintik yang intens pada titik-titik kontak sel-dengan-sel dan sebuah pola staining difus dalam sitoplasma. Sel-sel dalam zona labyrintin mengekspresikan pola difus staining dalam sitoplasma dengan pelabelan yang sedikit lebih intens pada titik-titik pertemuan sel-dengan-sel. Menariknya, sebuah berkas tunggal sel yang terletak diantara zona labyrintin dan spongiotrofoblast mengekspresikan intensitas staining yang lebih tinggi dibanding sel-sel pada zona labyrintin atau spongiotrobfoblast.
Gambar 1, D-F, menunjukkan pola staining dari αv dalam plasenta mencit. Pada palasenta pasca-implantasi awal, subunit integrin ini terlokalisasi ke ectoplacental cone dan sel-sel raksasa trofoblast (Gbr. 1D). Sel-sel raksasa trofoblast dari tahap-tahap selanjutnya (> hari kehamilan 10) memiliki pola staining difus yang berkolokalisasi ke membran plasma (Gambar 1E). Zona spongioblast dan zona labyrintin dan plat chorionik menunjukkan staining dengan variasi kehamilan, walaupun zona spongiotrofoblast lebih intensif dibanding zona labyrintin atau plat chorionik. Zona spongiotrofblast menunjukkan intensitas staining yang berkurang pada sampel plasenta hari kehamilan 16 dan 18, tetapi masih tetap lebih intens dibanding bagian-bagian lainnya (Gbr. 1F). Staining sel-sel spongiotrofoblast untuk αv yang ditonjolkan dalam lokalisasi perinuklear dan memberikan pola staining difus dalam sitoplasma dan pada membran plasma sel. Staining dalam zona labyrintin juga difus.
Ekspresi subunit integrin β1 dalam plasenta yang berkembang pada hari kehamilan 8 ditunjukkan pada Gambar 1, G-I. Ecoplacental cone dan sel-sel raksasa trofoblast dari konseptus pasca-inflamasi awal yang distaining kuat untuk subunit integrin β1 (Gambar 1G). Gambar 1H menunjukkan sel-sel raksasa trofoblast mulai dari plasenta hari kehamilan 12, yang menunjukkan staining kuat dalam tipe sel ini. Stain (noda) yang ditimbulkan uji staining terlokalisasi pada membran plasma dan tampak menunjukkan pola difus dan memusat pada permukaan sel. Zona-zona spongiotrofoblast dan labyrintin dan plat chorinik memilikis taining kuat walaupun ada perbedaan dikalangan sel dalam zona spongiotrofoblast (Gambar 1I). Semua sel dalam zona labyrintin menunjukkan pola staining difus dalam sitoplasma pada permukaan sel.
Ectoplasental cone dan sel raksasa trofoblast dari konseptus pasca-implantasi (hari kehamilan 8) memiliki staining positif (Gbr. 1J) untuk subunit integrin β3. Sel-sel raksasa dari plasenta dewasa (hari kehamilan 12) menunjukkan pola memusat pada membran plasma (Gambar 1K). Sel-sel dari zona spongiotrofoblast dan zona labyrintin dan plat chorionik memiliki staining yang kurang intensif. Walaupun intensitas staining pada sel-sel spongiotrofoblast dan labyrintin pada umumnya mirip. Pola-pola spesifik bagian dapat dideteksi (Gambar 1L). Integrin β3 dalam zona labyrintin terlaokalisasi utamanya pada membran sel, sedangkan sel-sel dari lapisan spongiotrofoblast memiliki pola staining difus dalam sitoplasma. Tidak perbedaan yang ditemukan selama kehamilan.
Gambar 1M menunjukkan bahwa pada hari kehamilan 8, reseptor balik untuk integrin α4β1, VCAM-1, dideteksi pada ectoplacental cone dan pada sel-sel raksasa trofoblast dari konseptus pasca-implantasi awal. Sel-sel raksasa trofoblast dari plasenta dewasa (hari kehamilan 12) menunjukkan hasil positif lemah untuk VCAM-1 dan menunjukkan pola staining difus pada perifer sel (Gbr. 1N). Zona psongiotrofoblast menunjukkan hasil positif lemah dengan sebuah pola difus, seperti diilustrasikan untuk hari kehamilan 16 pada Gambar 1O. Zona-zona labyrintin dan plat chorionic mengandung sedikit VCAM-1 walaupun beberapa sel lebih intensif dibanding lainnya. Secara umum, pola staining adalah difus pada zona labyrintin dan zona spongiotrofoblast, dengan beberapa staining yang terlokalisasi pada titik-titik kontak sel-dengan-sel.
Ciri-ciri staining yang utama untuk subunit integrin α4, αv, β1, dan β3 dan VCAM-1 dirangkum pada Tabel 4.
Ekspresi Sub-sub unit integrin dan mRNA VCAM-1 dalam plasenta
Eksperimen-eksperimen di ata smenunjukkan bahwa sel-sel plasenta mengekspresikan subunit integrin dan protein VCAM. Sehingga, ekspreimen-eksperimen selanjutnya dilakukan untuk menentukan apakah protein-protein ini ditranskripsi dalam plasenta. MRNA poly(A)+ diisolasi dari unit-unit uteroplasental (hari kehamilan 6, 8) dan plasenta (hari kehamilan 10, 12, 14, 16, dan 18). RNA duta untuk subunit integrin spesifik α4, αv, β1, dan β3 serta VCAM-1 dideteksi pada semua unit uteroplasental dan plasenta yang diuji. Gambar 2 menunjukkan analisis RT-PCR semikuantitatif dari unit-unit plasenta hari kehamilan 8 dan plasenta hari kehamilan 16. Subunit integrin dan mRNA VCAM-1 terdapat selama kehamilan, sehingga menandakan bahwa protein-protein ini ditranskripsi dalam plasenta. Menariknya, kadar untuk mRNA β3 rendah jika dibandingkan dengan kadar mRNA G3PDH walaupun protein dapat dideteksi dengan mudah melalui imunofluoresensi tidak langsung (Gbr. 1, J-L). Sebaliknya, mRNA VCAM-1 dideteksi pada konsentrasi yang lebih tinggi dibanding mRNA G3PDH, tetapi protein diekspresikan tidak kuat pada plasenta dewasa. Data-data ini menunjukkan regulasi diferensial pada tingkat transkripsi dan translasi.
Ekspresi Subunit Integrin dan VCAM-1 dalam kelompok sel trofoblast mencit
Dengan menentukan bahwa protein dan pesan untuk sub-sub unit integrin dan VCAM-1 terdapat dalam plasenta yang sedang berkembang, eksperimen selanjutnya dilakukan untuk menyelidiki kebadaan panel sub-sub unit yang sama dan protein VCAM-1 dan mRNA dalam kelompok sel trofoblastis mencit SM9-1. Seperti ditunjukkan pada gambar 3, pola dan intensitas sub-sub unit integrin dan ekspresi VCAM-1 pada sel-sel SM9-1 sejalan dengan ekspresi protein-protein sama dalam plasenta. Gambar 3A menunjukkan pola staining dari subunit integrin α4 sebagaimana dideteksi dengan imunofluoresensi langsung. Sel-sel SM9-1 menunjukkan pola staining perinuklear yang kuat dan pola yang berbeda tetapi difus di sepanjang batas-batas sel. Seperti terlihat pada gambar 3B, subunit integrin αv dideteksi pada tatanan perinuklear dan ditemukan pada batas sel-dengan-sel. Antibodi terhadap subunit αv menunjukkan pola staining berbeda yang ditandai dengan alur radial di dekat pinggir sel yang menonjol. Berbeda dengan itu, staining untuk subunit β1 sangat intens dan terlokalisasi ke daerah perinuklear dan kontak sel-dengan-sel dengan beberapa staining intraseluler (Gbr. 3D). Demikian juga, seperti terlihat pada Gambar 3E, staining untnuk VCAM-1 tidak intens, walaupun protein dideteksi dalam sitoplasma dan pada tempat-tempat adhesi sel.
MRNA poly(A)+ diisolasi dari sel-sel SM9-1 yang dikulturkan dan dianalisis untuk keberadaan panel subunit integrin yang sama dan transkrip VCAM-1. Gambar 4 menunjukkan keberadaan pesan spesifik dari masing-masing gen subunit integrin dan gen VCAM-1 dalam kelompok sel SM9-1. Masing-masing kelompok primer menghasilkan amplicon dengan ukuran yang diharapkan untuk masing-masing subunit integrin dan VCAM-1 (lihat Tabel 2 dan Gbr. 2). Mirip dengan pengamatan-pengamatan pada mRNA plasenta, sinyal-sinyal dengan intensitas lebih tinggi diamati untuk subunit integrin α4, αv, dan β1 dan transkrip-transkrip VCAM-1 dibanding untuk subunit integrin β3.
PEMBAHASAN
Walaupun integrin dan VCAM-1 diketahui penting bagi pembentukan dan berfungsinya plasenta, masih sedikit yang diketahui tentang ekspresi protein-protein ini selama perkembangan. Tujuan utama dari penelitian ini adalah untuk mengidentifikasi pola-pola ekspresi normal dari ekspresi kelompok subunit integrin tertentu dan VCAM-1 sebagai sebuah fungsi kehamilan. Kami menemukan bahwa 1) protein untuk sub-sub unit integrin (α4, αv, β1, dan β3) dan VCAM-1 diekspresikan di dalam plasenta mencit yang sedang berkembang, dan 2) mRNA untuk sub-sub unit integrin tertentu dan VCAM-1 terdapat dalam unit uteroplasental dan plasenta. Tujuan kedua adalah untuk menentukan apakah sel plasenta SM9-1 mengekspresikan protein dan transkrip untuk panel pilihan dari sub-sub unit integrin dan VCAM-1. Eksperimen-eksperimen ini menunjukkan bahwa sel plasenta SM9-1 mengekspresikan mRNA untuk molekul-molekul adhesi sama yang diidentifikasi dalam plasenta.
Transkripsi gen integrin α4 dan ekspresi protein serta dimernya yang sesuai, β1, dalam plasenta yang berkembang tidak mengherankan. Kedua protein ini diperlukan untuk implantasi normal dan perkembangan plasenta, sebagaimana ditunjukkan pada mencit dengan mutasi null untuk protein-protein ini. Penelitian terbaru menunjukkan bahwa protein untuk subunit integrin α4 dalam perkembangan plasenta tidak diketahui, antibodi-antibodi yang menggangu fungsi bagi integrin α4β1 bisa terlibat dalam pembentukan sebuah tempat yang berkaitan dengan sistem imun.
Ekspresi mRNA subunit integrin β1 dan protein pada perkembangan plasenta lebih kompleks. Jika β1 membentuk heterodimer hanya dengan α4, maka lokalisasi stain akan identik, tetapi bukan ini yang terjadi. Pengamatan kami bahwa dia bisa staining integrin β1 lebih intens dibanding staining integrin α4 dalam zona labyrintin menunjukkan bahwa dia bisa terikat ke sub-sub unit integrin α berbeda. Subunit β1 merupakan subunit integrin yang paling tidak konsisten dan bisa mengikat 12 subunit α berbeda, termasuk dua subunit α yang diteliti dalam penelitian. Ini kemungkinan karena sifat β1 yang kompleks sehingga mencit yang tidak mengandung subunit β1 mati pada sekitar hari kehamilan 5.
Pola-pola ekspresi mRNA αv dan β3 dan protein-protein pada plasenta mencit yang dilaporkan disini membuktikan dan memperluas pengamatan yang dilakukan oleh peneliti lain yang menunjukkan bahwa protein subunit αv dan β3 diekspresikan secara konstitutif pada trofoblast sampai hari kehamilan 8. Meskipun protein untuk subunit integrin β3 diekspresikan sama banyaknya dalam lapisan spongiotrofoblast dan labyrintin, sel-sel spongiotrofoblast mengekspresikan kadar protein subunit integrin αv yang lebih tinggi dibadning lapisan labyrintin. Data dari penelitian ini menunjukkan bahwa intensitas staining αv lebih kuat dibanding integrin β3 dalam zona spongiotrofoblast, sehingga menunjukkan bahwa αv bisa berdimerisasi dengan subunit integrin lainnya (seperti β1, β5, β6) dalam zona tersebut dan bisa mencerminkan perbedaan karakter invasif dari tipe-tipe sel ini. Famili integrin αv sangat penting dalam angiogenesis, neovaskularisasi, dan migrasi tumor. Karena angiogenesis dan neovaskularisasi penting untuk fungsi normal plasenta, dan transfer nutrien dan faktor-faktor penting lainnya terhadap janin yang sedang tumbuh, ekspresi αv yang menyimpang bisa menghasilkan kondisi-kondisi yang merusak bagi pertumbuhan dan perkembangan janin.
Transkripsi mRNA VCAM-1 dalam unit-unit uteroplasental, dan ekspresi protein VCAM-1 dalam ectoplasental cone dan sel raksasa trofoblast pada kehamilan awal menunjukkan bahwa protein ini penting untuk pembentukan plasenta dini, sebuah pendapat yang konsisten dengan pengamatan-pengamatan terdahulu tentang fungsi VCAM-1 pada pembentukan plasenta dini dengan menggunakan perusakan gen VCAM yang ditargetkan. VCAM-1 merupakan reseptor balik untuk integrin α4β1 dan diekspresikan pada berbagai tipe sel, dimana fungsi utamanya adalah untuk memperantarai adhesi sel-dengan-sel. Sehingga, VCAM-1 bisa bertindak bersama dengan α4β1 untnuk menghasilkan tempat imun dan/atau untuk membantu dalam interaksi sel-dengan-sel dalam pembentukan sebuah plasenta norma.
Sel plasenta SM9-1 diperiksa untuk mengetahui ekspresi mRNA dan protein molekul-molekul adhesi. Seperti dalam plasenta, sel-sel SM9-1 mengandung mRNA yang mengkodekan sub-sub unit integrin α4, αv, β1, dan β3, dan VCAM-1. Ekspresi protein dari molekul-molekul adhesi mirip atau bahkan identik dengan ekspresi pada zona labyrintin. Sebagai contoh, sel-sel SM9-1 memiliki staining sedang untuk subunit integrin αv dan staining intensif untuk subunit integrin β1. Karena VCAM-1 dan subunit integrin α4 dan β3 menunjukkan tidak ada perbedaan zona dalam hal staining dalam plasenta, maka mereka tidak bisa digunakan untuk membedakan antara zona spongiotrofoblast dan zona labyrintin. Sehingga, sel plasenta SM0-1 bisa menjadi sebuah model untuk meneliti regulasi dan fungsi molekul-molekul adhesi trofoblast.
Keterlibatan integrin pada perkembangan plasenta normal tidak diragukan lagi, sebagaimana ditunjukkan dalam penelitian dengan mencit mutan. Penelitian ini menunjukkan untuk pertama kalinya bahwa plasenta mencit mengnadung mRNA dan protein untuk sub-sub unit integrin α4, αv, β1, dan β3 dan VCAM-1 yang berbeda-beda selama kehamilan. Karakterisasi ekspresi integrin dalam plasenta yang berkembang normal akan membantu merancang penelitian-penelitian di masa mendatang untuk meneliti faktor-faktor parakrin yang memodulasi molekul-molekul adhesi plasenta dan interaksi antara molekul adhesi dan sitokin seperti faktor nekrosis tumor α. Pengidentifikasian pola-pola ekspresi dalam sel trofoblast menjadi dasar untuk masa depan dalam penelitian-penelitian in vitro terhadap regulasi molekul-molekul adhesi.
Integrin dan molekul adhesi sel-1 (VCAM-1) diperlukan untuk perkembangan plasenta yang normal. Dalam penelitian ini, subunit integrin α4, αv, β1, dan β3, dan VCAM-1 diteliti untuk ekspresi pada unit-unit uteroplasenta (hari 6 dan 8 kehamilan) dan plasenta (hari 10, 12, 14, 16, dan 18 kehamilan) dengan metode RT-PCR dan protein (yang dideteksi dengan imunofluoresensi) terdapat dalam semua jaringan selama kehamilan. VCAM-1 diekspresikan dengan intensitas kuat dalam ectoplacental cone dan sel-sel raksasa trofoblast, α4 diekspresikan kuat oleh sel-sel raksasa trofoblast dan diekspresikan sedang oleh spongiotrofoblast dan trofoblast labyrintin, dan αv diekspresikan lebih kuat dalam spongiotrofoblast dibanding dalam zona labyrintin. Β1 diekspresikan lebih kuat dalam labyrintin dibanding dalam zona spongiotrofoblast, sedangkan β3 dan VCAM-1 secara esensial sama pada kedua zona. Sel-sel SM9-1 yang mirip trofoblast positif untuk semua molekul adhesi saat diuji dengan RT-PCR dan imunositokimia. Ekspresi molekul adhesi pada sel-sel SM9-1 konsisten dengan ekspresi dalam zona labyrinthin. Secara kolektif, hasil dari penelitian ini menunjukkan bahwa plasenta mencit mengandung mRNA dan protein untuk α4, αv, β1, β3, dan VCAM-1, dan sehingga ekspresi yang terjadi spesifik sel. Hasil ini dan pengidentifikasian sel trofoblastis yang mengekspresikan molekul adhesi akan mempermudah penelitian di masa mendatang tentang fungsi molekul adhesi dalam perkembangan plasenta.
PENDAHULUAN
Famili integrin dari jenis glikoprotein diekspresikan dalam uterus semua spesies yang telah diteliti sampai sekarang ini. Pola-pola ekspresi integrin terkait dengan perkembangan blastosist, implantasi, dan perkembangan plasenta tanpa tergantung pada tipe plasentasi. Protein-protein heterodimerik yang dependen kation ini, yang terdiri dari sub-sub unit α dan β, berpartisipasi dalam adhesi sel-dengan-sel dan sel-dengan-substrat. Sekurang-kurangnya 23 kombinasi heterodimer diketahui terbentuk dari 17 subunit α dan 8 subunit β yang telah diidentifikasi sekarang ini. Spesifitas ligan dari heterodimer integrin ditentukan oleh kombinasi subunit α dan β.
Pola-pola ekspresi yang bervariasi dari sub-sub unit integrin tertentu dalam uterus mencit selama siklus reproduktif dan kehamilan menunjukkan bahwa protein-protein ini terlibat langsung dalam proses implantasi dan pembentukan plasenta normal serta fungsinya. Regulasi ekspresi sub-sub unit ini selama masa perkembangan dalam blastosist mencit juga konsisten dengan keterlibatan potensial dalam implantasi. Integrin berpartisipasi dalam beberapa fungsi yang diperlukan untuk plasentasi, termasuk adhesi sel, migrasi, dan invasi. Disamping itu, integrin terlibat dalam pensinyalan dua arah. Integrin diaktivasi atau mungkinan diaktivasi sebagai respons terhadap sebuah agonis atau perubahan tatanan sitoskeletan (pensinyalan dari dalam keluar) dan, ketika terikat ke sebuah ligan, bisa menginduksi berbagai peristiwa intraseluler yang bisa mengarah pada perubahan migrasi sel dan aktivasi gen (pensinyalan dari luar kedalam). Sehingga, integrin menarik sebagai partisipan potensial dalam kejadian-kejadian kompleks implantasi dan plasentasi.
Beberapa subunit integrin (α1, α2, α4-α7, β1, dan β3) telah diidentifikasi dalam sel-sel trofoblast normal embrio mencit sebelum dan selama implantasi, dan tampak bahwa ekspresi normal oleh subunit integrin α4, αv, dan β1 bisa terkait dengan kegagalan implantasi dan perkembangan plasenta abnormal. Pada mencit yang tidak mengandung subunit integrin α4, membran chorionik dan allantoik gagal bergabung, dan janin mati pada atau di sekitar hari 9 kehamilan. Gangguan-gangguan serupa terjadi pada penggabungan membran choriallantoik pada mencit yang kekurangan molekul adhesi sel vaskuler (VACM-1). VCAM-1 merupakan reseptor balik untuk α4β1. Mencit yang membawa mutasi dalam subunit integrin αv menunjukkan kelainan-kelainan pembentukan pembuluh darah yang menghasilkan pendarahan vaskular. Walaupun banyak mencit yang tidak mengandung subunit integrin αv mati segera setelah lahir, namun beberapa mati selama kehamilan, sehingga menandakan abnormalitas plasenta yang mungkin. Mencit dengan penghapusan tertargetkan pada subunit integrin β1, yang terikat ke 11 subunit α berbeda, mati selama tahap pra-implantasi sebagai akibat dari kegagalan massal sel innder.
Walaupun protein-protein yang terikat membran telah ditentukan penting untuk pembentukan plasenta yang baik dalam mencit dengan teknologi knock-out, namun pola-pola ekspresinya dalam plasenta sebagai sebuah fungsi kehamilan belum diketahui dengan baik. Dengan demikian, pada penelitian kali ini, analisis RT-PCR dan imunohistokimia digunakan untuk mengidentifikasi ekspresi spasial dan temporal sub-sub unit integrin (α4, αv, β1, dan β3) dan protein VCAM-1 dan mRNA dalam plasenta mencit. Disamping itu, sebuah kumpulan sel yang diambil dari plasenta mencit Siwss-Webster pada hari 9 kehamilan dengan menggunakan teknik imunohistokimia dan RT-PCR utnuk menentukan potensinya dalam penggunaan sebagai model in vitro untuk meneliti regulasi dan fungsi molekul-molekul adhesi trofoblast.
BAHAN DAN METODE
Mencit dan Pengambilan Sampel Jaringan
Sekelompok mencit Swiss-Webster dipeliharan sesuai dengan panduan-panduan dari Aminal Use and Care Committee Universitas Kansas Medical Center yang menyuplai jaringan yang digunakan untuk penelitian ini. Uterus dikumpulkan dari mencit-mencit hamil (keberadaan plug vaginal menandakan hari 1 kehamilan) pada hari 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 kehamilan (3 mencit/hari kehamilan). Untuk mikroskopi imunofluoresensi, unit-0unit uteroplasenta (jaringan embrionik dan uteroplasenta) diiris melintang dan dibekukan dalam senaywa OCT pada uap nitrogen cair dan disimpan pada suhu -80oC. Disamping itu, sampel-sampel plasenta dibekukan kilat dalam nitrogen cair dan disimpan pada suhu -80oC untuk analisis dengan RT-PCR.
Kultur Sel
Sebuah kelompok sel yang diambil dari plasenta mencit Swiss-Wester pada hari 9 kehamilan (SM9-1) dengan menggunakan metode-metode yang telah disebutkan sebelumnya (keberadaan plug vaginal dipertimbangkan sebagai har kehamilan 0) ditumbuhkan dalam corong kultur jaringan 75 cm2 dalam RPMI 1640 yang mengandung antibiotik dan disuplementasi dengan serum janin bovine 10% dan 50 µM mercapto-etanol pada suhu 37oC, 5% CO2. Semua eksperimen dilakukan pada sel plasenta. Untuk pemeriksaan imunohistokimia, sel-sel SM9-1 ditumbuhkan pada Slide Chamber LabTek. Untuk analisis RT-PCR, sel-sel SM9-1 dari dua corong 75-cm2 sekitar 80% kerapatannya, dipanen dengan pengerukan sel dari corong, digumpalkan, dan dibekukan pada suhu -80oC untuk ekstraksi selanjutnya dengan mRNA poli(A)+.
Imunofluoresensi Tidak Langsung
Irisan-irisan tempat-tempat implantasi dan plasenta (ketebalan irisan antara 4 sampai 8 µm) dari tiga mencit berbeda per hari kehamilan (n = 3) diambil dengan menggunakan alat cryostat dan dipasang pada slide Superfrost berlapis Plus. Jaringan dan sel SM9-1 yang melekat ke Slide Chamber LabTek dicuci dalam PBS dan dibekukan dalam aseton -20oC selama 10 menit, dicuci dalam PBS dengan 0,3% Tween-20, dan diblokir dengan BSA 1% dan serum kambing 3% dalam PBS selama 30 menit pada suhu kamar. Irisan-irisan jaringan dan sel pada slide kaca selanjutnya diinkubasi dengan sebuah antibodi primer (Tabel 1) atau IgG kontrol yang cocok (kontrol negatif) selama 1 jam pada suhu 37oC. Setelah beberapa pencucian pada PBS yang mengandung 0,3% Tween-20, irisan-irisan jaringan dan sel-sel diinkubasi dengan sebuah antibodi kambing sekunder bergugus biotinil terhadap spesies host antibodi primer. Sampel-sampel diinkubasi dengan fluoresein-streptavidin selama 30 menit pada suhu kamar. Semua slide ditutupi dengan sebuah kaca dan medium yang mengandung gliserol-gelatin dengan 1% pehnol. Slide-slide diamati dengan menggunakan Nikon Axiophot2 yang dilengkapi dengan epifluoresensi, difoto, dan diberi skor oleh dua pengamat independen menggunakan sistem skoring staining negatif (-), lemah (±), sedang (+), atau kuat (++) seperti dijelaskan dalam literatur.
RT-PCR
mRNA poli(A)+ diisolasi dari sel-sel SM9-1 dan unit-unit uteroplasenta Swiss-Webster (hari kehamilan 6 dan 8) dan plasenta (hari kehamilan 10, 12, 14, 16, 18) dari tiga mencit berbeda per hari kehamilan (n = 3) dengan menggunakan alat isolasi mRNA. Terkecuali virus leukemia mencit (MuLV) transkriptase terbalik (mRT), bufer mRT, dan inhibitor RNasin ribonuklease (Rnase), yang dibeli dari Promega (Madison, WI), semua komponen prosedur ini dibeli dari perusahaan Perkin-Elmer. Analisis RT-PCR menggunakan primer-primer dan kondisi-kondisi yang sebelumnya telah disebutkan dalam ltieratur. Tabel 2 memberikan urutan-urutan primer dan kondisi-kndisi siklus. Sinyal gliseraldehida-3-fosfat dehidrogenase (G3PDH) mRNA digunakan sebagai kontrol pemuatan. Sebanyak 500 nanogram sampel di transkripsi balik dalam 20 µl campuran reaksi yang mengandung 5 mM MgCl2, 1 M masing-masing dari dATP, dCTP, dGTP, dan dTTP, 10 U/ml Rnasin, 10 U/m; mRT, 5 µM oligo dt(16), dan buffer (25oC, 10 menit; 42oC, 60 menit; 99oC, 5 menit; 5oC, 5 menit; Perkin-Elmer Model 1400 thermocycler). Reaksi RT diikuti dengan reaksi PCR yang dilakukan pada total volume 100 µl yang mengandung 2 mM MgCl2, bufer PCR kekuatan tunggal II, 2,5 U/100 µl polimerase DNA ApliTaq, dan 1 µM masing-masing dari primer 5' dan primer 3'. Produk-produk PCR dan penanda berat molekuler dipisahkan pada gel-gel agarosa 3% yang mengandung etidium bromida dan divisualisasikan dengan sinar ultraviolet.
HASIL
Unit-unit uteroplasenta (hari 6 dan 8 kehamilan) dan plasenta (hari 10, 12, 14, 16, dan 18) diperiksa untuk mengetahui ekspresi sub-sub unit integrin (α4, αv, β1, dan β3) dan protein VCAM-1. Hasilnya dirangkum pada Tabel 3.
Ekspresi Sub-sub unit integrin dan protein VCAM-1 dalam plasma
Pada seri eksperimen pertama, ekspresi subunit integrin α4, αv, β1 dan β3 dalam unit-unit uteroplasenta dan plasenta diamati dengan menggunakan imunofluresensi. Semua subunit integrin dan VCAM-1 menunjukkan pola-pola ekspresi spesifik yang berbeda sebagai sebuah fungsi tahapan kehamilan. Walaupun tujuan dari penelitian ini adalah untuk meneliti molekul-molekul adhesi dalam plasenta, staining dalam desidua juga dipertimbangkan.
Gambar 1A menunjukkan bahwa pada hari kehamilan 8, subunit integrin α4 diekspresikan dalam ectopalsental cone dan sel-sel raksasa trofoblast pada konseptus postimplantasi. Sel-sel raksasa trofoblast selama kehamilan menunjukkan pola ekspresi berbintik yang tampak berkolokalisasi pada permukaan membran plasma (Gbr. 1B). Dari hari kehamilan 10 sampai melahirkan, staining dideteksi pada semua zona plasenta. Zona spongioblast dan zona labyrintin serta plat chorionik dianggap intensif. Seperti ditunjukkan pada Gambar 1C, zona spngioblast memiliki pola staining berbintik yang intens pada titik-titik kontak sel-dengan-sel dan sebuah pola staining difus dalam sitoplasma. Sel-sel dalam zona labyrintin mengekspresikan pola difus staining dalam sitoplasma dengan pelabelan yang sedikit lebih intens pada titik-titik pertemuan sel-dengan-sel. Menariknya, sebuah berkas tunggal sel yang terletak diantara zona labyrintin dan spongiotrofoblast mengekspresikan intensitas staining yang lebih tinggi dibanding sel-sel pada zona labyrintin atau spongiotrobfoblast.
Gambar 1, D-F, menunjukkan pola staining dari αv dalam plasenta mencit. Pada palasenta pasca-implantasi awal, subunit integrin ini terlokalisasi ke ectoplacental cone dan sel-sel raksasa trofoblast (Gbr. 1D). Sel-sel raksasa trofoblast dari tahap-tahap selanjutnya (> hari kehamilan 10) memiliki pola staining difus yang berkolokalisasi ke membran plasma (Gambar 1E). Zona spongioblast dan zona labyrintin dan plat chorionik menunjukkan staining dengan variasi kehamilan, walaupun zona spongiotrofoblast lebih intensif dibanding zona labyrintin atau plat chorionik. Zona spongiotrofblast menunjukkan intensitas staining yang berkurang pada sampel plasenta hari kehamilan 16 dan 18, tetapi masih tetap lebih intens dibanding bagian-bagian lainnya (Gbr. 1F). Staining sel-sel spongiotrofoblast untuk αv yang ditonjolkan dalam lokalisasi perinuklear dan memberikan pola staining difus dalam sitoplasma dan pada membran plasma sel. Staining dalam zona labyrintin juga difus.
Ekspresi subunit integrin β1 dalam plasenta yang berkembang pada hari kehamilan 8 ditunjukkan pada Gambar 1, G-I. Ecoplacental cone dan sel-sel raksasa trofoblast dari konseptus pasca-inflamasi awal yang distaining kuat untuk subunit integrin β1 (Gambar 1G). Gambar 1H menunjukkan sel-sel raksasa trofoblast mulai dari plasenta hari kehamilan 12, yang menunjukkan staining kuat dalam tipe sel ini. Stain (noda) yang ditimbulkan uji staining terlokalisasi pada membran plasma dan tampak menunjukkan pola difus dan memusat pada permukaan sel. Zona-zona spongiotrofoblast dan labyrintin dan plat chorinik memilikis taining kuat walaupun ada perbedaan dikalangan sel dalam zona spongiotrofoblast (Gambar 1I). Semua sel dalam zona labyrintin menunjukkan pola staining difus dalam sitoplasma pada permukaan sel.
Ectoplasental cone dan sel raksasa trofoblast dari konseptus pasca-implantasi (hari kehamilan 8) memiliki staining positif (Gbr. 1J) untuk subunit integrin β3. Sel-sel raksasa dari plasenta dewasa (hari kehamilan 12) menunjukkan pola memusat pada membran plasma (Gambar 1K). Sel-sel dari zona spongiotrofoblast dan zona labyrintin dan plat chorionik memiliki staining yang kurang intensif. Walaupun intensitas staining pada sel-sel spongiotrofoblast dan labyrintin pada umumnya mirip. Pola-pola spesifik bagian dapat dideteksi (Gambar 1L). Integrin β3 dalam zona labyrintin terlaokalisasi utamanya pada membran sel, sedangkan sel-sel dari lapisan spongiotrofoblast memiliki pola staining difus dalam sitoplasma. Tidak perbedaan yang ditemukan selama kehamilan.
Gambar 1M menunjukkan bahwa pada hari kehamilan 8, reseptor balik untuk integrin α4β1, VCAM-1, dideteksi pada ectoplacental cone dan pada sel-sel raksasa trofoblast dari konseptus pasca-implantasi awal. Sel-sel raksasa trofoblast dari plasenta dewasa (hari kehamilan 12) menunjukkan hasil positif lemah untuk VCAM-1 dan menunjukkan pola staining difus pada perifer sel (Gbr. 1N). Zona psongiotrofoblast menunjukkan hasil positif lemah dengan sebuah pola difus, seperti diilustrasikan untuk hari kehamilan 16 pada Gambar 1O. Zona-zona labyrintin dan plat chorionic mengandung sedikit VCAM-1 walaupun beberapa sel lebih intensif dibanding lainnya. Secara umum, pola staining adalah difus pada zona labyrintin dan zona spongiotrofoblast, dengan beberapa staining yang terlokalisasi pada titik-titik kontak sel-dengan-sel.
Ciri-ciri staining yang utama untuk subunit integrin α4, αv, β1, dan β3 dan VCAM-1 dirangkum pada Tabel 4.
Ekspresi Sub-sub unit integrin dan mRNA VCAM-1 dalam plasenta
Eksperimen-eksperimen di ata smenunjukkan bahwa sel-sel plasenta mengekspresikan subunit integrin dan protein VCAM. Sehingga, ekspreimen-eksperimen selanjutnya dilakukan untuk menentukan apakah protein-protein ini ditranskripsi dalam plasenta. MRNA poly(A)+ diisolasi dari unit-unit uteroplasental (hari kehamilan 6, 8) dan plasenta (hari kehamilan 10, 12, 14, 16, dan 18). RNA duta untuk subunit integrin spesifik α4, αv, β1, dan β3 serta VCAM-1 dideteksi pada semua unit uteroplasental dan plasenta yang diuji. Gambar 2 menunjukkan analisis RT-PCR semikuantitatif dari unit-unit plasenta hari kehamilan 8 dan plasenta hari kehamilan 16. Subunit integrin dan mRNA VCAM-1 terdapat selama kehamilan, sehingga menandakan bahwa protein-protein ini ditranskripsi dalam plasenta. Menariknya, kadar untuk mRNA β3 rendah jika dibandingkan dengan kadar mRNA G3PDH walaupun protein dapat dideteksi dengan mudah melalui imunofluoresensi tidak langsung (Gbr. 1, J-L). Sebaliknya, mRNA VCAM-1 dideteksi pada konsentrasi yang lebih tinggi dibanding mRNA G3PDH, tetapi protein diekspresikan tidak kuat pada plasenta dewasa. Data-data ini menunjukkan regulasi diferensial pada tingkat transkripsi dan translasi.
Ekspresi Subunit Integrin dan VCAM-1 dalam kelompok sel trofoblast mencit
Dengan menentukan bahwa protein dan pesan untuk sub-sub unit integrin dan VCAM-1 terdapat dalam plasenta yang sedang berkembang, eksperimen selanjutnya dilakukan untuk menyelidiki kebadaan panel sub-sub unit yang sama dan protein VCAM-1 dan mRNA dalam kelompok sel trofoblastis mencit SM9-1. Seperti ditunjukkan pada gambar 3, pola dan intensitas sub-sub unit integrin dan ekspresi VCAM-1 pada sel-sel SM9-1 sejalan dengan ekspresi protein-protein sama dalam plasenta. Gambar 3A menunjukkan pola staining dari subunit integrin α4 sebagaimana dideteksi dengan imunofluoresensi langsung. Sel-sel SM9-1 menunjukkan pola staining perinuklear yang kuat dan pola yang berbeda tetapi difus di sepanjang batas-batas sel. Seperti terlihat pada gambar 3B, subunit integrin αv dideteksi pada tatanan perinuklear dan ditemukan pada batas sel-dengan-sel. Antibodi terhadap subunit αv menunjukkan pola staining berbeda yang ditandai dengan alur radial di dekat pinggir sel yang menonjol. Berbeda dengan itu, staining untuk subunit β1 sangat intens dan terlokalisasi ke daerah perinuklear dan kontak sel-dengan-sel dengan beberapa staining intraseluler (Gbr. 3D). Demikian juga, seperti terlihat pada Gambar 3E, staining untnuk VCAM-1 tidak intens, walaupun protein dideteksi dalam sitoplasma dan pada tempat-tempat adhesi sel.
MRNA poly(A)+ diisolasi dari sel-sel SM9-1 yang dikulturkan dan dianalisis untuk keberadaan panel subunit integrin yang sama dan transkrip VCAM-1. Gambar 4 menunjukkan keberadaan pesan spesifik dari masing-masing gen subunit integrin dan gen VCAM-1 dalam kelompok sel SM9-1. Masing-masing kelompok primer menghasilkan amplicon dengan ukuran yang diharapkan untuk masing-masing subunit integrin dan VCAM-1 (lihat Tabel 2 dan Gbr. 2). Mirip dengan pengamatan-pengamatan pada mRNA plasenta, sinyal-sinyal dengan intensitas lebih tinggi diamati untuk subunit integrin α4, αv, dan β1 dan transkrip-transkrip VCAM-1 dibanding untuk subunit integrin β3.
PEMBAHASAN
Walaupun integrin dan VCAM-1 diketahui penting bagi pembentukan dan berfungsinya plasenta, masih sedikit yang diketahui tentang ekspresi protein-protein ini selama perkembangan. Tujuan utama dari penelitian ini adalah untuk mengidentifikasi pola-pola ekspresi normal dari ekspresi kelompok subunit integrin tertentu dan VCAM-1 sebagai sebuah fungsi kehamilan. Kami menemukan bahwa 1) protein untuk sub-sub unit integrin (α4, αv, β1, dan β3) dan VCAM-1 diekspresikan di dalam plasenta mencit yang sedang berkembang, dan 2) mRNA untuk sub-sub unit integrin tertentu dan VCAM-1 terdapat dalam unit uteroplasental dan plasenta. Tujuan kedua adalah untuk menentukan apakah sel plasenta SM9-1 mengekspresikan protein dan transkrip untuk panel pilihan dari sub-sub unit integrin dan VCAM-1. Eksperimen-eksperimen ini menunjukkan bahwa sel plasenta SM9-1 mengekspresikan mRNA untuk molekul-molekul adhesi sama yang diidentifikasi dalam plasenta.
Transkripsi gen integrin α4 dan ekspresi protein serta dimernya yang sesuai, β1, dalam plasenta yang berkembang tidak mengherankan. Kedua protein ini diperlukan untuk implantasi normal dan perkembangan plasenta, sebagaimana ditunjukkan pada mencit dengan mutasi null untuk protein-protein ini. Penelitian terbaru menunjukkan bahwa protein untuk subunit integrin α4 dalam perkembangan plasenta tidak diketahui, antibodi-antibodi yang menggangu fungsi bagi integrin α4β1 bisa terlibat dalam pembentukan sebuah tempat yang berkaitan dengan sistem imun.
Ekspresi mRNA subunit integrin β1 dan protein pada perkembangan plasenta lebih kompleks. Jika β1 membentuk heterodimer hanya dengan α4, maka lokalisasi stain akan identik, tetapi bukan ini yang terjadi. Pengamatan kami bahwa dia bisa staining integrin β1 lebih intens dibanding staining integrin α4 dalam zona labyrintin menunjukkan bahwa dia bisa terikat ke sub-sub unit integrin α berbeda. Subunit β1 merupakan subunit integrin yang paling tidak konsisten dan bisa mengikat 12 subunit α berbeda, termasuk dua subunit α yang diteliti dalam penelitian. Ini kemungkinan karena sifat β1 yang kompleks sehingga mencit yang tidak mengandung subunit β1 mati pada sekitar hari kehamilan 5.
Pola-pola ekspresi mRNA αv dan β3 dan protein-protein pada plasenta mencit yang dilaporkan disini membuktikan dan memperluas pengamatan yang dilakukan oleh peneliti lain yang menunjukkan bahwa protein subunit αv dan β3 diekspresikan secara konstitutif pada trofoblast sampai hari kehamilan 8. Meskipun protein untuk subunit integrin β3 diekspresikan sama banyaknya dalam lapisan spongiotrofoblast dan labyrintin, sel-sel spongiotrofoblast mengekspresikan kadar protein subunit integrin αv yang lebih tinggi dibadning lapisan labyrintin. Data dari penelitian ini menunjukkan bahwa intensitas staining αv lebih kuat dibanding integrin β3 dalam zona spongiotrofoblast, sehingga menunjukkan bahwa αv bisa berdimerisasi dengan subunit integrin lainnya (seperti β1, β5, β6) dalam zona tersebut dan bisa mencerminkan perbedaan karakter invasif dari tipe-tipe sel ini. Famili integrin αv sangat penting dalam angiogenesis, neovaskularisasi, dan migrasi tumor. Karena angiogenesis dan neovaskularisasi penting untuk fungsi normal plasenta, dan transfer nutrien dan faktor-faktor penting lainnya terhadap janin yang sedang tumbuh, ekspresi αv yang menyimpang bisa menghasilkan kondisi-kondisi yang merusak bagi pertumbuhan dan perkembangan janin.
Transkripsi mRNA VCAM-1 dalam unit-unit uteroplasental, dan ekspresi protein VCAM-1 dalam ectoplasental cone dan sel raksasa trofoblast pada kehamilan awal menunjukkan bahwa protein ini penting untuk pembentukan plasenta dini, sebuah pendapat yang konsisten dengan pengamatan-pengamatan terdahulu tentang fungsi VCAM-1 pada pembentukan plasenta dini dengan menggunakan perusakan gen VCAM yang ditargetkan. VCAM-1 merupakan reseptor balik untuk integrin α4β1 dan diekspresikan pada berbagai tipe sel, dimana fungsi utamanya adalah untuk memperantarai adhesi sel-dengan-sel. Sehingga, VCAM-1 bisa bertindak bersama dengan α4β1 untnuk menghasilkan tempat imun dan/atau untuk membantu dalam interaksi sel-dengan-sel dalam pembentukan sebuah plasenta norma.
Sel plasenta SM9-1 diperiksa untuk mengetahui ekspresi mRNA dan protein molekul-molekul adhesi. Seperti dalam plasenta, sel-sel SM9-1 mengandung mRNA yang mengkodekan sub-sub unit integrin α4, αv, β1, dan β3, dan VCAM-1. Ekspresi protein dari molekul-molekul adhesi mirip atau bahkan identik dengan ekspresi pada zona labyrintin. Sebagai contoh, sel-sel SM9-1 memiliki staining sedang untuk subunit integrin αv dan staining intensif untuk subunit integrin β1. Karena VCAM-1 dan subunit integrin α4 dan β3 menunjukkan tidak ada perbedaan zona dalam hal staining dalam plasenta, maka mereka tidak bisa digunakan untuk membedakan antara zona spongiotrofoblast dan zona labyrintin. Sehingga, sel plasenta SM0-1 bisa menjadi sebuah model untuk meneliti regulasi dan fungsi molekul-molekul adhesi trofoblast.
Keterlibatan integrin pada perkembangan plasenta normal tidak diragukan lagi, sebagaimana ditunjukkan dalam penelitian dengan mencit mutan. Penelitian ini menunjukkan untuk pertama kalinya bahwa plasenta mencit mengnadung mRNA dan protein untuk sub-sub unit integrin α4, αv, β1, dan β3 dan VCAM-1 yang berbeda-beda selama kehamilan. Karakterisasi ekspresi integrin dalam plasenta yang berkembang normal akan membantu merancang penelitian-penelitian di masa mendatang untuk meneliti faktor-faktor parakrin yang memodulasi molekul-molekul adhesi plasenta dan interaksi antara molekul adhesi dan sitokin seperti faktor nekrosis tumor α. Pengidentifikasian pola-pola ekspresi dalam sel trofoblast menjadi dasar untuk masa depan dalam penelitian-penelitian in vitro terhadap regulasi molekul-molekul adhesi.
Comments
Post a Comment