Cadherin II Sebagai Indikator Kehamilan Langgeng
Bidang penemuan
Penemuan ini terkait dengan produksi cadherin-II pada jaringan endometrial manusia sebagai sebuah indikator kemampuan menghasilkan atau mempertahankan sebuah kehamilan yang langgeng.
Latar belakang penemuan
Gangguan-gangguan molekuler yang bertanggung jawab atas masalah-masalah kesehatan reproduksi yang umum seperti kemandulan dan aborsi spontan yang rekuren atau sudah menjadi kebiasan belum sepenuhnya diketahui. Akan tetapi, diyakini bahwa kegagalan implantasi bisa berkontribusi bagi tingginya kasus-kasus seperti ini. Disamping itu, meskipun pengalaman semakin bertambah dengan bantuan teknologi-teknologi di bidang reproduksi, masih sedikit wanita yang mengalami pembuahan in vitro dan transfer embrio yang menghasilkan kehamilan yang langgeng. Faktor pembatas dalam setting ini bisa berupa kemampuan blastosis (pra-embrionik) untuk melekat dan/atau menginvasi endometrium uterin, sebuah proses yang dikenal sebagai implantasi.
Aborsi spontan rekuren (RSA), yang didefinisikan sebagai dua atau lebih keguguran berturut-turut dengan usia kehamilan kurang dari 20 pekan, merupakan sebuah masalah kesehatan yang umum dengan mengenai sampai 5% pasangan yang mencoba untuk memiliki anak. Faktor genetik (translokasi pasangan), faktor endokrin (penyakit tiroid, hiperprolkatinemia atau defisiensi fase luteal), faktor anatomi (septat uterus, adhesi intrauterin atau fibroid submukosa) dan faktor-faktor autoimun (antibodi antifosfolipid (APA) atau Sindrom Jaringan Konektif tidak-Terdiferensiasi (UCT) adalah faktor-faktor risiko yang telah diketahui untuk RSA. Kebanyakan (80%) RSA yang terkait endokrin adalah hasil dari defisiensi fase luteal (LPD), yang didefinisikan sebagai dua biopsi endometrial “di luar fase”, masing-masing mengandung 23 hari tundaan pematangan berdasarkan morfologi endometrial dan onset menstruasi selanjutnya.
Untuk menghasilkan kehamilan yang sukses, sel-sel trofoblas dari blastosis pra-embrionik harus berinteraksi dengan endometrium uterin selama periode siklus menstruasi tertentu (disebut sebagai jendela implantasi).
Di luar periode penerimaan ini, endometrium tidak mendukung implantasi. Perkembangan endometrium yang menyimpang atau “keluar jalur” selama siklus menstruasi telah ditemukan terkait dengan kegagalan implantasi, salah satu faktor yang diyakini sebagai pemicu RSA dan kemandulan. Mekanisme-mekanisme adhesif yang terlibat dalam pembentukan lingkungan uterin yang mendukung interaksi sel endometrial-trofoblas masih sedikit diketahui.
Tahapan pertama dalam implantasi manusia melibatkan perlekatan sel-sel trofoblast dari blastosis pra-embrionik ke epitelium permukaan dari endometrium uterin. Setelah itu, sel-sel trofoblas berproliferasi dan berinvasi ke dalam stroma endometrial yang bersangkutan. Sel-sel trofoblas berdiferensiasi ke dalam chorionic villi yang terdiri dari dua lapisan, yaitu: lapisan sel dalam, yang terdiri dari sitotrofoblas aktif-mitotik, dan trofoblas sinsitial luar, yang merupakan sel berinti banyak yang berdiferensiasi memusat dan terbentuk oleh penggabungan sitotrofoblas pasca-mitotik. Seiring dengan bertambahnya lama kehamilan, sitotrofoblas berproliferasi dan membentuk kolom-kolom yang meluas sampai ke laposan torfoblas sinsitial ke dalam maternal decidua. Kolom-kolom sitotrofoblas ekstravillious ini diyakini mengikat plasenta ke desidua.
Sitotrofoblas terpisah dari kolom-kolom ekstravilious dan menembus jauh ke dalam maternal vaskulatur dan desidua. Sitotrofoblas-sitotrofoblas yang invasif ini selanjutnya mengalami diferensiasi dan bergabung membentuk sel-sel raksasa pada plasenta, sel-sel berinti-banyak yang besar, yang terletak dekat dengan sel-sel desidua di sekitarnya.
Selama invasi endometrium, sel-sel trofoblas tidak hanya harus berinteraksi satu sama lain tetapi juga dengan populasi tipe-tipe sel berbeda yang membentuk endometrium.
Hormon-hormon steroid, progesteron (P4) dan 17β-estradiol (E2) memegang peranan penting dalam mempersiapkan endometrium untuk implantasi. Salah satu dari tahapan yang terlibat dalam persiapan endometrium melibatkan diferensiasi sel-sel stromal ke dalam sel-sel desidua, yang mengikat sel-sel trofoblas dan menghambat migrasi invasifnya.
Secara morfologi, desidualisasi ditandai dengan sebuah perubahan sel stromal menjadi bentuk sel polihedral dengan peningkatan ukuran sel. Secara ultrastruktural, terdapat perkembangan organel yang ekstensif, yang terlibat dalam sintesis protein (retikulum endoplasma kasar) dan sekresi (aparatus Golgi), dan kenampakan desmosom dan pertemuan antara sel-sel yang berdekatan.
Kedalaman invasi trofoblas sangat terkontrol, dan kesalahan-kesalahan memiliki dampak besar terhadap kesehatan ibu dan janin. Sebagai contoh, invasi trofoblas yang dangkal terkait dengan preeklampsia, sebuah penyakit yang menghasilkan morbiditas dan mortalitas yang signifikan pada ibu dan janin. Sebaliknya, tidak adanya desidua memungkinkan trofoblas menembus jauh ke dalam jaringan yang bersangkutan seperti pada kasus plasenta accreta atau kehamilan ektopik.
Cadherin adalah sebuah gen superfamili dari glikoprotein membran integral yang memperantarai adhesi sel dependen-kalsium dengan cara homofilik. Ekspresi spasiotemporal dari sub-sub tipe cadherin sangat teregulasi selama perkembangan. Sel-sel embrionik yang menunjukkan cadherin-cadherin klasik berbeda (cadherin tipe 1) terpisah satu sama lain dan diyakini bahwa cadherin-cadherin inilah yang menjadi basis molekuler bagi segregasi populasi sel dan pembentukan jaringan selanjutnya. Pada orang dewasa, cadherin terlokalisasi pada domain-domain membran dari pertemuan adheren-adheren dan diyakini mempertahankan keadaan sel yang terdiferensiasi.
Cadherin tipe 2 menunjukkan homologi asam amino keseluruhan yang rendah disertai cadherin klasik. Cadherin tipe 2 memiliki karakteristik urutan yang sama, seperti penghapusan atau penambahan asam amino karakteristik dan substitusi asam amino berbeda pada berbagai tempat, yang tidak ditemukan pada cadherin klasik. Khususnya, cadherin tipe 2 tidak mengandung urutan pengenal adhesi sel (CAR), HAV, yang terjaga diantara semua sub-tipe cadherin klasik. Cadherin-II (cad-II), yang juga dikenal sebagai OB-cadherin (OB-cad), merupakan sebuah cadherin tipe 2 yang tampak memegang peranan penting dalam morfogenesis.
Telah ditentukan bahwa cad-II ditampakkan dalam trofoblast sincitial tetapi tidak pada sitotrofoblas vilosa pada plasenta manusia. Ekspresi Cad-II juga terganggu dalam sitotrofoblas pada ujung distal kolom sitotrofoblas ekstravilosa dari plasenta trimester pertama. Dalam endometrium, cad-II diekspresikan secara spasiotemporal dalam epitelium glandular dan stroma selama siklus menstruasi. Kadar cad-II dalam epitelium permukaan dan glandular tetap relatif konstan selama siklus menstruasi. Cad-II tidak ditemukan dalam stroma selam fase proliferatif. Cad-II pertama kali dideteksi di sekitar arteri-arteri spiral dari stroma (area desidualisasi awal) selama fase sekretory akhir.
Kadar cad-II meningkat pada saat stroma terus mengalami desidualisasi dan kadar maksimum ditemukan dalam desidua pada awal-awal kehamilan. Telah ditemukan bahwa wanita yang mengalami kemandulan primer dan wanita yang memiliki kebiasaan aborsi menunjukkan kadar cad-II yang berkurang atau bahkan tidak ada dalam jaringan endometrium sebagaimana dibandingkan dengan wanita subur. Wanita yang memiliki kebiasaan aborsi tetapi mempertahankan sebuah kehamilan langgeng setelah pengobatan hormonal, menunjukkan kadar cad-II dalam endometrium yang sebanding dengan wanita subur. Sehingga, kapasitas untuk ekspresi cad-II atau produksi cad-II dalam jaringan endometrial, merupakan sebuah indikator kehamilan langgeng. Kadar ekspresi/produksi cad-II yang berkurang dalam jaringan endometrial menunjukkan ketidakmampuan untuk menghasilkan atau mempertahankan sebuah kehamilan.
Ringkasan penemuan. Penemuan ini merupakan sebuah metode untuk menentukan ketidakmampuan seorang wanita menghasilkan atau mempertahankan sebuah kehamilan, yang terdiri dari penentuan keberadaan sebuah gen yang mengkodekan cad-II normal dan cad-II fungsional pada sebuah sampel jaringan dari wanita.
Penemuan ini juga menjadi sebuah metode untuk menentukan ketidakmampuan seorang wanita subjek untuk menghasilkan atau mempertahankan sebuah kehamilan yang terdiri dari penentuan: (1) mRNA cad-II atau (2) protein cad-II, dari sel-sel endometrial wanita subjek.
Temuan ini juga merupakan sebuah metode untuk menentukan kemampuan seorang wanita dalam menghasilkan atau mempertahankan sebuah kehamilan yang terdiri dari penentuan kadar mRNA cad-II atau protein cad-II dari jaringan endometrial seorang wanita. Metode-metode ini bisa mencakup perbandingan penentuan kadar cad-II pada wanita subjek dengan kadar standar yang memberikan indikasi kemampuan untuk menghasilkan atau mempertahankan sebuah kehamilan pada seorang perempuan. Kadar standar bisa diperoleh dengan menentukan kadar mRNA cad-II atau kadar protein cad-II dalam sebuah sampel jaringan standar atau sel yang diketahui mengekspresikan cad-II (seperti plasenta, paru-paru, ginjal, limpa, testis, ovarium, atau usus) atau jaringan endometrial atau sel-sel dari wanita subur yang diketahui.
Kadar mRNA cad-II atau protein cad-II dalam sampel standar bisa ditentukan pada saat dimana penentuan kadar pada wanita subjek dilakukan atau kadar standar bisa ditentukan terlebih dahulu dan informasi dari penentuan ini dibandingkan dengan penentuan yang dilakukan pada wanita subjek.
Sampel standar bisa berupa sampel buatan. Misalnya, untuk penentuan cad-II yang dilakukan pada serum, ekstrak sel, dan lain-lain, standar bisa berupa larutan yang mengandung mRNA atau protein cad-II yang dimaksudkan untuk menghasilkan penentuan cad-II yang merupakan indikasi dari kadar cad-II yang terkait dengan jaringan endometrial seorang wanita subur.
Untuk perbandingan kadar cad-II pada wanita subjek dengan kadar standar yang diperoleh dari jaringan endometrial seorang wanita subur yang diketahui, diperlukan agar sampel-sampel jaringan dari wanita uji dan wanita subur yang telah diketahui diambil pada saat yang kira-kira sama selama siklus menstruasi, misalnya pada pertengahan sampai akhir fase sekretory (20-45 siklus mentruasi). Siklus menstruasi dimulai pada onset episode perdarahan menstruasi sampai pada onset selanjutnya. Pada wanita usia reproduktif, siklus menstruasi rata-rata 28 hari. Sehingga, hari pertama sebuah siklus adalah hari pertama dari menstruasi, dan hari ke-28 akan menjadi hari episode perdarahan menstruasi selanjutnya. Waktu optimal untuk daya terima endometrial terhadap blastosit atau implantasi embrio adalah sekitar hari ke-20 sampai ke-24 dari siklus menstruasi tersebut.
Sehingga aspek penemuan ini bisa menjadi sebuah metode untuk menentukan kemungkinan pembentukan atau pertahanan sebuah kehamilan yang terdiri dari penentuan kadar produksi cadherin-II oleh sel-sel endometrial dari seorang wanita subjek dan membandingkan kadar tersebut dengan sebuah kadar standar yang merupakan sebuah indikasi dari kemampuan untuk menghasilkan atau mempertahankan sebuah kehamilan pada seorang subjek wanita subur, dimana kadar yang berkurang relatif terhadap standar yang dimaksud menandakan ketidakmampuan untuk menghasilkan atau mempertahankan sebuah kehamilan.
Seperti disebutkan pada contoh 1 dan 2 berikut ini, penentuan produksi cad-II oleh endometrium bisa membantu dalam mendiagnosis wanita yang mengalami kebiasaan aborsi atau RSA termasuk wanita yang mengalami defisiensi fase luteal (PLD) serta wanita yang mengalami ketidaksuburan.
Lebih lanjut diduga bahwa protein cad-II yang dihasilkan oleh endometrium bisa terpecah dan dilepaskan ke dalam serum sehingga kadar protein cad-II yang dideteksi dalam serum bisa berkorelasi dengan produksi cad-II oleh endometrium. Sehingga, aspek ini juga bisa dipraktekkan dengan menentukan kadar cad-II dalam sampel darah seperti serum atau plasma, dan membandingkan kadar tersebut dengan kadar standar dalam sebuah sampel darah dari seorang subjek wanita. Seperti dengan sampel jaringan endometrial, sampel darah harus diambil pada saat yang kira-kira sama selama siklus menstruasi.
Penemuan ini juga menjadi sebuah sarana untuk melakukan penentuan cad-II secara imunologi untuk menentukan ketidakmampuan bagi seorang wanita menghasilkan atau mempertahankan sebuah kehamilan yang terdiri dari antibodi atau fragmen antibodi yang mampu terikat ke cad-II manusia. Sarana ini bisa mencakup reagen-reagen untuk pendeteksian antibodi atau fragmen antibodi ketika terikat ke cad-II. Sarana ini juga bisa sebuah wadah atau beberapa wadah untuk komponen sarana tersebut.
Penemuan ini juga menjadi sebuah sarana untuk melakukan penentuan mRNA cad-II dalam rangka menentukan ketidakmampuan seorang wanita untuk menghasilkan atau mempertahankan sebuah kehamilan yang terdiri dari satu atau lebih primer oligonukleotida yang berhibridisasi dengan mRNA cad-II. Alat ini bisa mencakup reagen-reagen untuk transkripsi terbalik (RT) darn mRNA.
Penemuan ini juga memanfaatkan antibodi atau fragmen antibodi yang mampu terikat ke cad-II untuk pendeteksian cad-II dalam jaringan endometrial untuk menentukan ketidakmampuan seorang wanita menghasilkan kehamilan atau mempertahankan kehamilan, atau untuk menentukan kemampuan seorang wanita dalam menghasilkan dan mempertahankan sebuah kehamilan.
Penemuan ini juga menggunakan homolog-homolog oligonukleotida dengan mRNA cad-II untuk pendeteksian mRNA cad-II dalam jaringan endometrial untuk menentukan ketidakmampuan seorang wanita dalam menghasilkan atau mempertahankan sebuah kehamilan, atau untuk menentukan kemampuan seorang wanita untuk menghasilkan atau mempertahankan sebuah kehamilan.
Penemuan ini juga memanfaatkan progestin untuk meningkatkan produksi cad-Ii dalam jaringan endometrial.
Lazimnya, terapi yang meningkatkan kesuburan untuk pasien yang mengalami disfungsi endometrial melibatkan pemberian progestin yang cocok seperti progesteron (seperti P4), pregnenolon atau medroksiprogesteron, atau sebuah agen yang meningkatkan kadar protestin dalam sebuah pasien (seperti clomifen atau gonadotrofin). Progestin meningkatkan cad-II dalam jaringan endometrial dan pengobatan seperti ini bisa dilakukan dalam kombinasi dengan metode-metode temuan ini dimana cad-II dari jaringan endometrial ditentukan.
Seperti ditunjukkan pada contoh 1 disini, penentuan kadar produksi cad-II dengan endometrium merupakan sebuah indikator keberhasilkan terapi hormonal (progestin) untuk memperbaiki kesuburan. Kadar ekspresi cad-II yang tinggi setelah terapi fertilitas hormonal terkait dengan penjagaan sebuah kehamilan yang langgeng. Seperti disebutkan pada contoh 2 berikut, cad-Ii merupakan penanda yang bermanfaat untuk pematangan fase luteal dan daya terima endometrial. Sehingga, aspek lain dari penemuan ini adalah bahwa kadar ekspresi cad-Ii endometrial ditentukan dan digunakan sebagai dasr untuk menyesiakan dosis hormon peningkat progestin atau obat (seperti progesteron atau clomifen) yang diberikan kepada wanita sehingga tingkat produksi cad-II (sebuah penanda daya terima endometrial) meningkat. Walaupun morfologi sel endoemtrial saat ini digunakan untuk mentitrasi dosis hormon, ekspresi cad-II diindikasikan disini lebih baik dalam memprediksikan daya respon endometrial dan daya penerimaannya. Diduga bahwa seorang dokter bisa memantau kadar ekspresi cad-II endometrial oleh seorang wanita yang mengalami terapi kesuburan hormonal dan menyesuaikan dosis sehingga eksrepsi cad-II mendekati kadar ekspresi cad-II yang diamati pada subjek-subjek wanita subur yang dapat menerima implamntasi. Pemantauan distribusi cad-II dan/atau tingkat ekspresi juga bisa digunakan untuk menentukan waktu optimal bagi implantasi (waktu optimal dari daya terima endometrial).
Dengan demikian, aspek temuan ini menyediakan sebuah metode untuk menentukan daya terima endometrial terhadap implantasi blastosit yang terdiri dari penentuan tingkat produksi cadherin-II oleh sel-sel endometrial seorang wanita subjek yang sedang mengalami terapi peningkatan progestin dan lebih lanjut bisa terdiri dari tahapan untuk menyesuaikan terapi yang dimaksud untuk meningkatkan tingkat produksi cadherin-II, atau lebih jauh terdiri dari tahapan untuk menentukan waktu optimal bagi blastosis atau implantasi. Penentuan produksi cadherin-II bisa dibandingkan dengan sebuah standar sebagaimana disebutkan di atas.
Meski demikian, aspek lebih jauh dari temuan ini menunjukkan perbaikan kesuburan seorang wanita dengan meningkatkan ekspresi cad-II oleh endometrium, misalnya dengan menggunakan terapi gen.
Berdasarkan aspek ini, DNA yang mengkodekan cad-II yang terkait dengan urutan-urutan kontrol ekspresi bisa disalurkan atau ditransfer ke sel-sel endometrial melalui konstruk-konstruk DNA seperti vektor adenoviral.
Atau, teknik-teknik rekombinan homolog bisa digunakan untuk mentransfer kontrol ekspresi gen cad-II endogen ke urutan kontrol ekspresi berbeda. Yang juga diduga adalah penggunaan DNA pengkode cad-II untuk pembuatan sebuah obat untuk meningkatkan ekspresi cad-II dengan sel-sel endometrial melalui penyaluran DNA seperti ini ke sel-sel endometrial.
Urutan-urutan oligonukleotida yang bisa digunakan sebagai primer atau probe untuk urutan pengkodean cad-II, mRNA atau cDNA sebagaimana disebutkan disini telah diketahui sebelumnya telah dibuat dan digunakan untuk tujuan-tujuan tersebut. Informasi tentang urutan yang ditunjukkan dalam SEQ ID NO;1, atau dalam Tanihara dkk., supra, bisa langsung digunakan untuk membuat urutan-urutan oligonukleotida yang sesuai untuk digunakan pada temuan ini selain yang dijelaskan secara khusus dalam literatur sampai sekarang ini.
Produksi antibodi-antibodi terhadap cad-II dan hibriboma yang menghasilkan antibodi-antibodi monoklonal terhadap cad-II disebutkan pada contoh 10 berikut. Antibodi-antibodi terhadap cad-II juga bisa dibuat berdasarkan prosedur-prosedur yang telah ditentukan, khususnya prosedur-prosedur yang disebutkan dalam Paten A.S. No. 5.597.725 disamping menggunakan informasi urutan cDNA dalam SEQ ID NO;1, protein (atau sebuah fragmen imunogenik dari protein) yang didapatkan dari SEQ ID NO:1 atau urutan asam amino sesuai yang disebutkan dalam SEQ ID NO;4, atau informasi urutan yang disebutkan oleh Tanihara, dkk, supra.
Antibodi-antibodi monoklonal yang lebih dipilih disebut sebagai Cli-113E dan CII-113H, yang masing-masing dihasilkan oleh hidridoma yang dideposisikan oleh ICOS Corporation pada 21 April 1998 di American Type Culture Collection.
Salah satu hal dimana metode penemuan ini bisa dilakukan adalah dengan menguji keberadaan sebuah gen yang mengkodekan cad-II dalam setiap sampel jaringan seorang pasien yang cocok. Tidak adanya gen seperti ini atau adanya mutasi akan menandakan ketidakmampuan mendasar bagi pasien untuk mengekspresikan cad-II dalam jaringan manapun sehingga akan menjadi indikator kesuburan pasien tersebut. Ketika gen untuk cad-II bermutasi atau tidak ada, wanita yang bersangkutan mungkin tidak mampu menghasilkan atau mempertahankan kehamilan yang langgeng. Pada sebuah uji untuk keberadaan sebuah gen yang mengkodekan cad-II dalam DNA genomik, tidak jadi masalah bahwa sebuah sampel jaringan (seperti kulit, hapusan bukal, atau rambut) merupakan salah satu dimana ekspresi cad-Ii tidak terjadi pada orang dewasa. Metode ini mencakup hibridisasi (annealling) terhadap DNA genomik yang tercerna dari cDNA cad-II (seperti ditunjukkan pada SEQ ID NO:1, atau sebuah fragmen) dan pendeteksian DNA terhibridisasi berdasarkan prosedur yang telah ditentukan, termasuk yang disebutkan dalam Paten Amerika Serikat No. 5.597.725. Atau, mutasi-mutasi dalam gen yang mengodekan cad-II bisa dideteksi dengan menggunakan metode manapun yang diketahui, termasuk yang disebutkan dalam Eng dkk. Aspek lain dari penemuan ini adalah pendeteksian ekspresi/produksi cad-II dalam jaringan endometrial dari seorang pasien. Semua metode yang diketahui dalam literatur untuk pendeteksian RNA spesifik atau protein dari sebuah ekstrak seluler atau pada sebuah spesimen jaringan bisa digunakan. Sebagai contoh, setiap cara uji imunologi yang menggunakan antibodi anti-cad-II bisa dilakukan dengan menggunakan sebuah ekstrak selular atau sebuah spesimen jaringan (jika memungkinkan). Lebih disukai antibodi adalah antibodi monoklonal yang spesifik untuk cad-II.
Metode ini akan melibatkan sebuah sistem pendeteksian yang cocok dimana pengikatan antibodi ke cad-II dideteksi. Setiap sistem pendeteksian seperti ini yang mungkin diketahui dalam ltiteratur bisa digunakan, termasuk pemantauan produksi sebuah imunopresipitat, penggunaan antibodi berlabel, pemisahan elektroforesis dan pendeteksian kompleks antibodi-antiogen berlabel atau berwarna (seperti Western Blot), uji lapus antibodi, uji imunohistologi (termasuk imunohistokimia, imunofluoresensi), dan sitometri alir.
Metode penemuan ini yang menggunakan sebuah antibodi anti-cad-II bisa dilakukan pada spesimen-spesimen jaringan endometrial yang dibuat secara histologi. Uji imunohistokimia dan imunofluoresen khususnya bermanfaat untuk spesimen-spesimen histologi dan metodologi ini memungkinkan pendeteksian produksi cad-II yang terkait dengan sel-sel endometrial berbeda sehingga memungkinkan perbandingan antara sel-sel epitelium dan stromal. Prosedur-prosedur untuk pemisahan sel-sel epitelium dan stroma bisa digunakan sebelum metodologi yang cocok lainnya dari temuan ini yang melibatkan preparasi ekstrak-ekstrak seluler.
Intensitas imunostaining cad-II dalam biopsi endometrial bisa ditentukan dengan tekni HSCORE semikuantitatif yang rutin digunakan dalam oncology untuk jumlah sel kanker. HSCORE merupakan sebuah nilai kontinyu (dari 0-4, masing-masing), dimana sebuah tingkat diskriminasi yang diberi nilai positif dan negatif untuk tes ditentukan. Lazimnya, kesepakatan terbentuk antara jumlah yang dilakukan oleh dua pengamat dengan cara samar yang menggunakan mikroskop berkepala ganda pada pembesaran rendah dan tinggi.
Ekspresi cad-II tampak negatif atau lemah (HSCORe = -1) atau memiliki ekspresi tinggi (HSCORE = 3-4) dalam stroma dan epitelium endometrium sekretory. Sehingga, pada sebuah perbandingan tingkat produksi cad-II dari spesimen biopsi endometrial uji dengan tingkat produks cad-II dari spesimen biopsi endometrial standar dengan HSCORE 3-4 (seperti, dari subjek wanita subur dengan kemampuan untuk menghasilkan dan mempertahankan kehamilan, atau dari subjek wanita subur selama periode waktu dimana mereka bersikap terbuka terhadap implantasi blastosit), maka spesimen uji dengan HSCORE 0-2 menunjukkan bahwa subjek uji tidak mampu menghasilkan atau mempertahankan kehamilan.
Pengukuran ekspresi cad-II yang lebih detail dalam komponen epitelium atau stromal dari endometrium bisa diterapkan pada tes. Pada kondisi-kondisi ini, HSCORE akan dihitung dengan menggunakan persamaan berikut: E Pi (i + 1) dimana i = intensitas staining (0 = tidak ada staining; 1 = lemah; 2 = sedang; dan 3 = staining kuat) dan Pi adalah persentase sel epitelium atau stromal yang terstaining untuk masing-masing intensitas, yang bervariasi antara 0% sampai 100%. Disamping itu, analisis ROC bisa diterapkan pada pengukuran HSCORe. Kurva ROC menunjukkan hubungan antara rasio true-positive dan rasio false-positive sebagai definisi dari uji positif. Program komputer yang dibuat untuk tujuan ini (seperti program SAS) bisa digunakan untuk menentukan nilai HSCORE yang optimal untuk digunakan memprediksikan, misalnya, LPD.
Metode-metode statistik dimana sampel-sampel uji bisa dibandingkan dengan sebuah standar juga telah diketahui. Sebagai contoh, hasil dari uji imunologi seperti ELISA, atau hasil dari PCR, bisa dianalisis dan dibandingkan dengan sebuah standar melalui analisis teknik varians (ANOVA).
Metode penemuan ini juga mencakup pendeteksian mRNA cad-II dalam ekstrak-ekstrak seluler dari jaringan endometrial. Dengan menggunakan informasi urutan cDNA yang diketahui untuk cad-II, semua metode pendeteksian mRNA atau recovery cDNA dari mRNA bisa digunakan. Sebagai contoh, analisis Northern Blot terhadap ekstrak-ekstrak seluler bisa dilakukan dengan menggunakan cDNA cad-II sebagai probe. Demikian juga, informasi urutan cDNA cad-II memungkinkan pembuatan dan penggunaan primer-primer dimana cDNA dari mRNA cad-II bisa dibuat dengan transkripsi terbalik menggunakan prosedur-prosedur yang baku. cDNA seperti ini bisa dideteksi, direcovery, atau diamplifikasi dengan reaksi rantai polimerase (PCR) dan DNA teramplifikasi yang dihasilkan dideteksi dengan menggunakan prosedur-prosedur baku. Hibridisasi in situ terhadap sebuah probe oligonukleotida berlabel terhadap mRNA cad-II bisa digunakan dalam penemuan ini untuk mendeteksi mRNA cad-II dalam sebuah jaringan atau spesimen selular.
Metode-metode dari temuan ini bisa mencakup satu atau lebih tahapan untuk mendapatkan sebuah sampel jaringan dari seorang pasien, baik dengan mempersiapkan sebuah ekstrak selular dari sampel jaringan atau dengan membuat sebuah spesimen histologis dari sampel jaringan, dengan menentukan keberadaan mRNA cad-II atau cad-II berdasarkan prosedur yang dijelaskan di atas, dan, dengan membandingkan hasil-hasil dari penentuan dengan hasil dari penentuan sama yang dilakukan dengan menggunakan jaringan dari wanita subur yang diketahui atau populasi wanita subur yang diketahui. Perbedaan mencolok pada produksi cad-II endometrial seperti antara wanita subur dan wanita tidak subur atau wanita yang mengalami kebiasaan aborsi atau RSA, memungkinkan penentuan ketidakmampuan atau kemampuan pasien uji untuk menghasilkan atau mempertahankan sebuah kehamilan, dan bisa membantu dalam mendiagnosa wanita-wanita yang menderita kebiasaan aborsi atau RSA, wanita yang mengalami defisiensi fase luteal (LPD), dan wanita-wanita yang mengalami ketidaksuburan primer yang tidak diketahui penyebabnya.
Juga diperkirakan bahwa cad-II bisa dipecah dan dilepas ke dalam serum wanita, sehingga penentuan kadar cad-II dalam plasma atau serum sebelum atau selama kehamilan dengan menggunakan, misalnya, uji ELISA, bisa dikorelasikan dengan kadar ekspresi cad-II oleh endometrium, yang pada gilirannya berkorelasi dengan kemampuan wanita untuk menghasilkan dan mempertahankan sebuah kehamilan yang langgeng. Penelitian-penelitian terbaru telah menunjukkan bahwa E-cad terpecah dan dilepaskan ke dalam serum pasien kanker. Pemantauan kadar cad-II dalam serum bisa menjadi uji yang kurang invasif untuk penentuan kemampuan menghasilkan dan mempertahankan sebuah kehamilan.
Penemuan ini juga menjadi sebuah sarana untuk melakukan metode-metode yang disebutkan di atas. Sarana ini bisa mencakup instruksi-instruksi untuk penggunaannya dan informasi atau tampilan-tampilan bergambar yang memungkinkan perbandingan dilakukan antara seorang pasien uji dan hasil yang diharapkan dari seorang wanita subur. Sarana ini bisa mencakup reagen, substrat-substrat mekanis dan sejenisnya yang bermanfaat dalam kinerja dalam metode-metode yang disebutkan di atas. Sebagai contoh, sebuah sarana yang cocok untuk penentuan cad-II secara imunohistokimia dalam sebuah spesimen jaringan endometrial bisa mencakup komponen-komponen berikut dalam wadah: (1) antibodi primer (seperti antibodi monoklonal mencit) terhadap cad-II manusia; (2) antibodi sekunder terhadap antibodi monoklonal (seperti antibodi anti IgG mencit dari kuda yang terbiotinilasi); (3) serum pemblokir (seperti dari kuda); (4) gugus yang dapat dideteksi untuk antibodi sekunder (seperti streptavidin – kompleks enzim terbiotinilasi atau reagen-reagen yang cocok untuk tujuan ini seperti larutan Avidin DH dan horseradish peroksidase terbiotinilasi).
Sebuah alat untuk penentuan mRNA akan mencakup oligonukleotida-oligonulleotida yang cocok yang berhibridisasi menjadi mRNA cad-II dan berfungsi sebagai primer-primer transkripsi terbalik (RT) atau probe.
Alat ini bisa mencakup reagen-reagen standar untuk transkripsi terbalik yang mencakup transkriptase terbalik yang sesuai dan bisa mencakup primer-primer yang cocok dan/atau enzim-enzim untuk amplifikasi cDNA. Sebuah alat yang terdiri dari primer-primer RT untuk cDNA cad-II bisa hanya mencakup primer-primer tersebut, pengepakan komersial dan instruksi-instruksi dan ditujukan untuk digunakan.
Penyaluran gen cad-II fungsional ke sel-sel yang sesuai dipengaruhi secara in vivo atau ex vivo dengan penggunaan vektor, dan lebih khusus lagi vektor virus, atau dengan penggunaan metode-metode transfer DNA. Atau, sel-sel endometrial bisa dimodifikasi untuk mengaktivasi gen cad-II endogen yang tidak normalnya diekspresikan atau sedang diekspresikan dengan jumlah rendah dibanding yang diharapkan. Modifikasi yang cocok bisa mengganti seluruh atau sebagian promoter cad-II yang terbentuk secara alami dengan sebagian atau semua dari promoter heterolog, misalnya dengan sebuah cara yang memungkinkan kontrol ekspresi cad-II dengan alat-alat eksternal.
Perwujudan tertentu yang mengilustrasikan temuan ini disebutkan pada beberapa contoh berikut ini.
Contoh 1:
Menguji produksi cad-II endometrial sebelum dan setelah pengobatan hormon tertentu (progesteron) pada wanita yang memiliki kebiasaan aborsi yang terkait dengan defisiensi fase luteal.
Ekspresi Cadherin-II pada wanita yang mengalami kebiasaan aborsi yang terkait dengan hormonal dalam penelitian ini didefinisikan sebagai tiga atau lebih keguguran spontan berturut-turut. Sampai sekarang ini, biopsi endometrial dianggap sebagai metode yang paling terpercaya dalam menentukan kemungkinan implantasi dan kehamilan dini. Akan tetapi, banyaknya perbedaan diantara patologist dan keakuratan rendah menunjukkan bahwa teknik ini tidak lagi dapat diterima. Ekspresi/produksi cad-II merupakan sebuah penanda yang sangat baik.
Keberadaan cad-II diuji pada biopsi-biopsi endometrial yang didapatkan dari wanita yang memiliki kebiasaan aborsi dalam kaitannya dengan defisiensi fase luteal (LPD). Kelompok wanita ini, yang mewakili sekitar 20% dari wanita yang mendatangi rumah sakit di Loss Clinic, B.C. Women's Hospital and Health Center, University of British Columbia, Vancouver, Canada, secara rutin diobati dengan progesteron atau clomifen sitrat. Spesimen-spesimen biopsi didapatkan dari wanita-wanita ini sebelum dan setelah pengobatan. ekspresi/produksi cad-II berkorelasi dengan hasil kehamilan selama pengobatan. Pengobatan LPD kali ini terdiri dari suppositori progesteron vaginal atau clomifen sitrat, dengan dosis yang disesuaikan sampai biopsi endometrial berulang dianggap “normal” melalui penilaian morfologis.
LPD didiagnosa dengan metode-metode tradisional sebelum menentukan cad-Ii dengan imunostaining. Untuk meningkatkan kemungkinan memasukkan individu-individu yang mengalami LPD autentik saja, kriteria inklusi dalam penelitian ini adalah dua biopsi berturut-turut dengan 2-3 hari penundaan pematangan berdasarkan hari pertama dari menstruasi selanjutnya sebagaimana ditentukan dengan penilaian morfologis.
Contoh 2.
Protokol sitometri alir untuk mendeteksi keberadaan cad-II pada permukaan sel-sel endometrial.
Jaringan-jaringan untuk sitometri alir didapatkan dalam fase folikular atau fase luteal dari siklus menstruasi, dengan menggunakan sampel endometrial. Sampel-sampel ditempatkan dalam sebuah medium steril (DMEM) yang disuplementasi dengan 10% serum anak sapi, 2% L-glutamin dan 1% penicillin-streptomysin. Sel-sel epitelium dan stromal diisolasi berdasarkan prosedur yang ada.
Sampel kontrol positif dari endometrium dicairkan untuk setiap sampel uji. Sebanyak empat tabung uji dibuat untuk masing-masing sampel uji. Sebuah studi rentang referensi bisa dilakukan, dengan menggunakan kontrol subur yang sehat, untuk menentukan persentil 2,5 bawah dari kurva distribusi.
Sampel-sampel endometrial disitosentrifugasi dan disuspensi dalam larutan garam normal. IgG kambing, 50 yl dari pengenceran 1/200 ditambahkan ke masing-masing enam tabung uji.
Tabung-tabung uji dipra-inkubasi pada 40oC selama 15 menit dan dicuci 2 kali dengan 2 mL PBS yang mengandung 0,1 k sdioum azida (NaN3) dan 1% FCS diikuti dengan sentrifugasi pada 400 xg pada suhu kamar selama 10 menit. Lapisan teratas didekantasi sehingga menyisakan sebuah pil sel kering pada dasar masing-masing tabung.
Untuk mengidentifikasi sel-sel glandular, 10 yl pengenceran optimal, yang ditentukan dengan titrasi serial dua kali dari masing-masing lot, dari antibodi monoklonal sitokeratin anti-manusia mencit (PE) tekronyugasi fikoerithrin ditambahkan ke dua dari empat tabung uji pada masing-masing kelompok. Untuk mengidentifikasi sel-sel stromal, 5 yl dari pengenceran optimal dari antibodi monoklonal 5B5 anti-manusia mencit PE ditambahkan ke tiga tabung uji lainnya pada masing-masing kelompok. Untuk mengidentifikasi keberadaan cadherin-II pada permukaan sel glandular atau sel stroma, 100 yl dari pengenceran optimal fragmen-fagmen F(ab')2 FITC dari antibodi monoklonal cadherin anti-manusia mencit dibuat dengan menggunakan alat preparasi IMMUNOPURETM Fab, ditambahkan ke empat tabung uji. Sebanyak 12 tabung kemudian diinkubasi selama 30 menit pada suhu 40oC.
Sel-sel dicuci dua kali dengan 2 mL PBS yang mengandung 0,1k NaN3 dan 1% FCS diikuti dengan sentrifugasi, pada 400 xg pada suhu kamar selama 10 menit. Lapisan teratas didekantasi sehingga menyisakan pil sel kering pada dasar setial tabung. Sel-sel diikat dalam 0,3 mL paraformaldehida 1%.
Sampel-sampel dianalisis dengan menggunakan sitometri alir EPICS Profile ITM. Data dikumpulkan dengan amplifikasi logaritmik, dan intensitas fluoresensi ditampilkan pada sebuah channel 256, skala log empat dekade.
Untuk masing-masing tabung, sebuah gerbang elektornik dibuat secara manual di sekitar populasi sampel. Fluroesensi pikoerithrin (PE) dari 10.000 sel dari dalam peta diplotkan pada sebuah histogram parameter, pada channel 265, skala log empat dekade. Sebuah gerbang jendela digambar lintas populasi sel positif PE. Fluoresensi FITC dalam gerbang jendela PE diplotkan terhadap sebuah histogram parameter tunggal, pada channel 256, skala log empat dekade. Sebuah kursor digambar lintas sumbu-x untuk menentukan fluoresensi FITC channel rata-rata logaritmik. Dengan menggunakan tabel yang disuplai oleh perusahaan yang membuat, fluoresensi saluran mean logaritmik dikonversi menjadi fluoresensi saluran mean linear. Pergeseran channel diselesaikan dengan mengurangi fluoresensi saluran mean linear dari kontrol negatif dengan sampel uji.
Judul Asli: Cadherin 11 As an Indicator of Viable Pregnancy
Penulis: Anonymous
Tahun: 2008
Sumber: http://www.wipo.intpctdbenwo.jspIA=CA1998000397&DISPLAY=DESC
Kata kunci:
Penemuan ini terkait dengan produksi cadherin-II pada jaringan endometrial manusia sebagai sebuah indikator kemampuan menghasilkan atau mempertahankan sebuah kehamilan yang langgeng.
Latar belakang penemuan
Gangguan-gangguan molekuler yang bertanggung jawab atas masalah-masalah kesehatan reproduksi yang umum seperti kemandulan dan aborsi spontan yang rekuren atau sudah menjadi kebiasan belum sepenuhnya diketahui. Akan tetapi, diyakini bahwa kegagalan implantasi bisa berkontribusi bagi tingginya kasus-kasus seperti ini. Disamping itu, meskipun pengalaman semakin bertambah dengan bantuan teknologi-teknologi di bidang reproduksi, masih sedikit wanita yang mengalami pembuahan in vitro dan transfer embrio yang menghasilkan kehamilan yang langgeng. Faktor pembatas dalam setting ini bisa berupa kemampuan blastosis (pra-embrionik) untuk melekat dan/atau menginvasi endometrium uterin, sebuah proses yang dikenal sebagai implantasi.
Aborsi spontan rekuren (RSA), yang didefinisikan sebagai dua atau lebih keguguran berturut-turut dengan usia kehamilan kurang dari 20 pekan, merupakan sebuah masalah kesehatan yang umum dengan mengenai sampai 5% pasangan yang mencoba untuk memiliki anak. Faktor genetik (translokasi pasangan), faktor endokrin (penyakit tiroid, hiperprolkatinemia atau defisiensi fase luteal), faktor anatomi (septat uterus, adhesi intrauterin atau fibroid submukosa) dan faktor-faktor autoimun (antibodi antifosfolipid (APA) atau Sindrom Jaringan Konektif tidak-Terdiferensiasi (UCT) adalah faktor-faktor risiko yang telah diketahui untuk RSA. Kebanyakan (80%) RSA yang terkait endokrin adalah hasil dari defisiensi fase luteal (LPD), yang didefinisikan sebagai dua biopsi endometrial “di luar fase”, masing-masing mengandung 23 hari tundaan pematangan berdasarkan morfologi endometrial dan onset menstruasi selanjutnya.
Untuk menghasilkan kehamilan yang sukses, sel-sel trofoblas dari blastosis pra-embrionik harus berinteraksi dengan endometrium uterin selama periode siklus menstruasi tertentu (disebut sebagai jendela implantasi).
Di luar periode penerimaan ini, endometrium tidak mendukung implantasi. Perkembangan endometrium yang menyimpang atau “keluar jalur” selama siklus menstruasi telah ditemukan terkait dengan kegagalan implantasi, salah satu faktor yang diyakini sebagai pemicu RSA dan kemandulan. Mekanisme-mekanisme adhesif yang terlibat dalam pembentukan lingkungan uterin yang mendukung interaksi sel endometrial-trofoblas masih sedikit diketahui.
Tahapan pertama dalam implantasi manusia melibatkan perlekatan sel-sel trofoblast dari blastosis pra-embrionik ke epitelium permukaan dari endometrium uterin. Setelah itu, sel-sel trofoblas berproliferasi dan berinvasi ke dalam stroma endometrial yang bersangkutan. Sel-sel trofoblas berdiferensiasi ke dalam chorionic villi yang terdiri dari dua lapisan, yaitu: lapisan sel dalam, yang terdiri dari sitotrofoblas aktif-mitotik, dan trofoblas sinsitial luar, yang merupakan sel berinti banyak yang berdiferensiasi memusat dan terbentuk oleh penggabungan sitotrofoblas pasca-mitotik. Seiring dengan bertambahnya lama kehamilan, sitotrofoblas berproliferasi dan membentuk kolom-kolom yang meluas sampai ke laposan torfoblas sinsitial ke dalam maternal decidua. Kolom-kolom sitotrofoblas ekstravillious ini diyakini mengikat plasenta ke desidua.
Sitotrofoblas terpisah dari kolom-kolom ekstravilious dan menembus jauh ke dalam maternal vaskulatur dan desidua. Sitotrofoblas-sitotrofoblas yang invasif ini selanjutnya mengalami diferensiasi dan bergabung membentuk sel-sel raksasa pada plasenta, sel-sel berinti-banyak yang besar, yang terletak dekat dengan sel-sel desidua di sekitarnya.
Selama invasi endometrium, sel-sel trofoblas tidak hanya harus berinteraksi satu sama lain tetapi juga dengan populasi tipe-tipe sel berbeda yang membentuk endometrium.
Hormon-hormon steroid, progesteron (P4) dan 17β-estradiol (E2) memegang peranan penting dalam mempersiapkan endometrium untuk implantasi. Salah satu dari tahapan yang terlibat dalam persiapan endometrium melibatkan diferensiasi sel-sel stromal ke dalam sel-sel desidua, yang mengikat sel-sel trofoblas dan menghambat migrasi invasifnya.
Secara morfologi, desidualisasi ditandai dengan sebuah perubahan sel stromal menjadi bentuk sel polihedral dengan peningkatan ukuran sel. Secara ultrastruktural, terdapat perkembangan organel yang ekstensif, yang terlibat dalam sintesis protein (retikulum endoplasma kasar) dan sekresi (aparatus Golgi), dan kenampakan desmosom dan pertemuan antara sel-sel yang berdekatan.
Kedalaman invasi trofoblas sangat terkontrol, dan kesalahan-kesalahan memiliki dampak besar terhadap kesehatan ibu dan janin. Sebagai contoh, invasi trofoblas yang dangkal terkait dengan preeklampsia, sebuah penyakit yang menghasilkan morbiditas dan mortalitas yang signifikan pada ibu dan janin. Sebaliknya, tidak adanya desidua memungkinkan trofoblas menembus jauh ke dalam jaringan yang bersangkutan seperti pada kasus plasenta accreta atau kehamilan ektopik.
Cadherin adalah sebuah gen superfamili dari glikoprotein membran integral yang memperantarai adhesi sel dependen-kalsium dengan cara homofilik. Ekspresi spasiotemporal dari sub-sub tipe cadherin sangat teregulasi selama perkembangan. Sel-sel embrionik yang menunjukkan cadherin-cadherin klasik berbeda (cadherin tipe 1) terpisah satu sama lain dan diyakini bahwa cadherin-cadherin inilah yang menjadi basis molekuler bagi segregasi populasi sel dan pembentukan jaringan selanjutnya. Pada orang dewasa, cadherin terlokalisasi pada domain-domain membran dari pertemuan adheren-adheren dan diyakini mempertahankan keadaan sel yang terdiferensiasi.
Cadherin tipe 2 menunjukkan homologi asam amino keseluruhan yang rendah disertai cadherin klasik. Cadherin tipe 2 memiliki karakteristik urutan yang sama, seperti penghapusan atau penambahan asam amino karakteristik dan substitusi asam amino berbeda pada berbagai tempat, yang tidak ditemukan pada cadherin klasik. Khususnya, cadherin tipe 2 tidak mengandung urutan pengenal adhesi sel (CAR), HAV, yang terjaga diantara semua sub-tipe cadherin klasik. Cadherin-II (cad-II), yang juga dikenal sebagai OB-cadherin (OB-cad), merupakan sebuah cadherin tipe 2 yang tampak memegang peranan penting dalam morfogenesis.
Telah ditentukan bahwa cad-II ditampakkan dalam trofoblast sincitial tetapi tidak pada sitotrofoblas vilosa pada plasenta manusia. Ekspresi Cad-II juga terganggu dalam sitotrofoblas pada ujung distal kolom sitotrofoblas ekstravilosa dari plasenta trimester pertama. Dalam endometrium, cad-II diekspresikan secara spasiotemporal dalam epitelium glandular dan stroma selama siklus menstruasi. Kadar cad-II dalam epitelium permukaan dan glandular tetap relatif konstan selama siklus menstruasi. Cad-II tidak ditemukan dalam stroma selam fase proliferatif. Cad-II pertama kali dideteksi di sekitar arteri-arteri spiral dari stroma (area desidualisasi awal) selama fase sekretory akhir.
Kadar cad-II meningkat pada saat stroma terus mengalami desidualisasi dan kadar maksimum ditemukan dalam desidua pada awal-awal kehamilan. Telah ditemukan bahwa wanita yang mengalami kemandulan primer dan wanita yang memiliki kebiasaan aborsi menunjukkan kadar cad-II yang berkurang atau bahkan tidak ada dalam jaringan endometrium sebagaimana dibandingkan dengan wanita subur. Wanita yang memiliki kebiasaan aborsi tetapi mempertahankan sebuah kehamilan langgeng setelah pengobatan hormonal, menunjukkan kadar cad-II dalam endometrium yang sebanding dengan wanita subur. Sehingga, kapasitas untuk ekspresi cad-II atau produksi cad-II dalam jaringan endometrial, merupakan sebuah indikator kehamilan langgeng. Kadar ekspresi/produksi cad-II yang berkurang dalam jaringan endometrial menunjukkan ketidakmampuan untuk menghasilkan atau mempertahankan sebuah kehamilan.
Ringkasan penemuan. Penemuan ini merupakan sebuah metode untuk menentukan ketidakmampuan seorang wanita menghasilkan atau mempertahankan sebuah kehamilan, yang terdiri dari penentuan keberadaan sebuah gen yang mengkodekan cad-II normal dan cad-II fungsional pada sebuah sampel jaringan dari wanita.
Penemuan ini juga menjadi sebuah metode untuk menentukan ketidakmampuan seorang wanita subjek untuk menghasilkan atau mempertahankan sebuah kehamilan yang terdiri dari penentuan: (1) mRNA cad-II atau (2) protein cad-II, dari sel-sel endometrial wanita subjek.
Temuan ini juga merupakan sebuah metode untuk menentukan kemampuan seorang wanita dalam menghasilkan atau mempertahankan sebuah kehamilan yang terdiri dari penentuan kadar mRNA cad-II atau protein cad-II dari jaringan endometrial seorang wanita. Metode-metode ini bisa mencakup perbandingan penentuan kadar cad-II pada wanita subjek dengan kadar standar yang memberikan indikasi kemampuan untuk menghasilkan atau mempertahankan sebuah kehamilan pada seorang perempuan. Kadar standar bisa diperoleh dengan menentukan kadar mRNA cad-II atau kadar protein cad-II dalam sebuah sampel jaringan standar atau sel yang diketahui mengekspresikan cad-II (seperti plasenta, paru-paru, ginjal, limpa, testis, ovarium, atau usus) atau jaringan endometrial atau sel-sel dari wanita subur yang diketahui.
Kadar mRNA cad-II atau protein cad-II dalam sampel standar bisa ditentukan pada saat dimana penentuan kadar pada wanita subjek dilakukan atau kadar standar bisa ditentukan terlebih dahulu dan informasi dari penentuan ini dibandingkan dengan penentuan yang dilakukan pada wanita subjek.
Sampel standar bisa berupa sampel buatan. Misalnya, untuk penentuan cad-II yang dilakukan pada serum, ekstrak sel, dan lain-lain, standar bisa berupa larutan yang mengandung mRNA atau protein cad-II yang dimaksudkan untuk menghasilkan penentuan cad-II yang merupakan indikasi dari kadar cad-II yang terkait dengan jaringan endometrial seorang wanita subur.
Untuk perbandingan kadar cad-II pada wanita subjek dengan kadar standar yang diperoleh dari jaringan endometrial seorang wanita subur yang diketahui, diperlukan agar sampel-sampel jaringan dari wanita uji dan wanita subur yang telah diketahui diambil pada saat yang kira-kira sama selama siklus menstruasi, misalnya pada pertengahan sampai akhir fase sekretory (20-45 siklus mentruasi). Siklus menstruasi dimulai pada onset episode perdarahan menstruasi sampai pada onset selanjutnya. Pada wanita usia reproduktif, siklus menstruasi rata-rata 28 hari. Sehingga, hari pertama sebuah siklus adalah hari pertama dari menstruasi, dan hari ke-28 akan menjadi hari episode perdarahan menstruasi selanjutnya. Waktu optimal untuk daya terima endometrial terhadap blastosit atau implantasi embrio adalah sekitar hari ke-20 sampai ke-24 dari siklus menstruasi tersebut.
Sehingga aspek penemuan ini bisa menjadi sebuah metode untuk menentukan kemungkinan pembentukan atau pertahanan sebuah kehamilan yang terdiri dari penentuan kadar produksi cadherin-II oleh sel-sel endometrial dari seorang wanita subjek dan membandingkan kadar tersebut dengan sebuah kadar standar yang merupakan sebuah indikasi dari kemampuan untuk menghasilkan atau mempertahankan sebuah kehamilan pada seorang subjek wanita subur, dimana kadar yang berkurang relatif terhadap standar yang dimaksud menandakan ketidakmampuan untuk menghasilkan atau mempertahankan sebuah kehamilan.
Seperti disebutkan pada contoh 1 dan 2 berikut ini, penentuan produksi cad-II oleh endometrium bisa membantu dalam mendiagnosis wanita yang mengalami kebiasaan aborsi atau RSA termasuk wanita yang mengalami defisiensi fase luteal (PLD) serta wanita yang mengalami ketidaksuburan.
Lebih lanjut diduga bahwa protein cad-II yang dihasilkan oleh endometrium bisa terpecah dan dilepaskan ke dalam serum sehingga kadar protein cad-II yang dideteksi dalam serum bisa berkorelasi dengan produksi cad-II oleh endometrium. Sehingga, aspek ini juga bisa dipraktekkan dengan menentukan kadar cad-II dalam sampel darah seperti serum atau plasma, dan membandingkan kadar tersebut dengan kadar standar dalam sebuah sampel darah dari seorang subjek wanita. Seperti dengan sampel jaringan endometrial, sampel darah harus diambil pada saat yang kira-kira sama selama siklus menstruasi.
Penemuan ini juga menjadi sebuah sarana untuk melakukan penentuan cad-II secara imunologi untuk menentukan ketidakmampuan bagi seorang wanita menghasilkan atau mempertahankan sebuah kehamilan yang terdiri dari antibodi atau fragmen antibodi yang mampu terikat ke cad-II manusia. Sarana ini bisa mencakup reagen-reagen untuk pendeteksian antibodi atau fragmen antibodi ketika terikat ke cad-II. Sarana ini juga bisa sebuah wadah atau beberapa wadah untuk komponen sarana tersebut.
Penemuan ini juga menjadi sebuah sarana untuk melakukan penentuan mRNA cad-II dalam rangka menentukan ketidakmampuan seorang wanita untuk menghasilkan atau mempertahankan sebuah kehamilan yang terdiri dari satu atau lebih primer oligonukleotida yang berhibridisasi dengan mRNA cad-II. Alat ini bisa mencakup reagen-reagen untuk transkripsi terbalik (RT) darn mRNA.
Penemuan ini juga memanfaatkan antibodi atau fragmen antibodi yang mampu terikat ke cad-II untuk pendeteksian cad-II dalam jaringan endometrial untuk menentukan ketidakmampuan seorang wanita menghasilkan kehamilan atau mempertahankan kehamilan, atau untuk menentukan kemampuan seorang wanita dalam menghasilkan dan mempertahankan sebuah kehamilan.
Penemuan ini juga menggunakan homolog-homolog oligonukleotida dengan mRNA cad-II untuk pendeteksian mRNA cad-II dalam jaringan endometrial untuk menentukan ketidakmampuan seorang wanita dalam menghasilkan atau mempertahankan sebuah kehamilan, atau untuk menentukan kemampuan seorang wanita untuk menghasilkan atau mempertahankan sebuah kehamilan.
Penemuan ini juga memanfaatkan progestin untuk meningkatkan produksi cad-Ii dalam jaringan endometrial.
Lazimnya, terapi yang meningkatkan kesuburan untuk pasien yang mengalami disfungsi endometrial melibatkan pemberian progestin yang cocok seperti progesteron (seperti P4), pregnenolon atau medroksiprogesteron, atau sebuah agen yang meningkatkan kadar protestin dalam sebuah pasien (seperti clomifen atau gonadotrofin). Progestin meningkatkan cad-II dalam jaringan endometrial dan pengobatan seperti ini bisa dilakukan dalam kombinasi dengan metode-metode temuan ini dimana cad-II dari jaringan endometrial ditentukan.
Seperti ditunjukkan pada contoh 1 disini, penentuan kadar produksi cad-II dengan endometrium merupakan sebuah indikator keberhasilkan terapi hormonal (progestin) untuk memperbaiki kesuburan. Kadar ekspresi cad-II yang tinggi setelah terapi fertilitas hormonal terkait dengan penjagaan sebuah kehamilan yang langgeng. Seperti disebutkan pada contoh 2 berikut, cad-Ii merupakan penanda yang bermanfaat untuk pematangan fase luteal dan daya terima endometrial. Sehingga, aspek lain dari penemuan ini adalah bahwa kadar ekspresi cad-Ii endometrial ditentukan dan digunakan sebagai dasr untuk menyesiakan dosis hormon peningkat progestin atau obat (seperti progesteron atau clomifen) yang diberikan kepada wanita sehingga tingkat produksi cad-II (sebuah penanda daya terima endometrial) meningkat. Walaupun morfologi sel endoemtrial saat ini digunakan untuk mentitrasi dosis hormon, ekspresi cad-II diindikasikan disini lebih baik dalam memprediksikan daya respon endometrial dan daya penerimaannya. Diduga bahwa seorang dokter bisa memantau kadar ekspresi cad-II endometrial oleh seorang wanita yang mengalami terapi kesuburan hormonal dan menyesuaikan dosis sehingga eksrepsi cad-II mendekati kadar ekspresi cad-II yang diamati pada subjek-subjek wanita subur yang dapat menerima implamntasi. Pemantauan distribusi cad-II dan/atau tingkat ekspresi juga bisa digunakan untuk menentukan waktu optimal bagi implantasi (waktu optimal dari daya terima endometrial).
Dengan demikian, aspek temuan ini menyediakan sebuah metode untuk menentukan daya terima endometrial terhadap implantasi blastosit yang terdiri dari penentuan tingkat produksi cadherin-II oleh sel-sel endometrial seorang wanita subjek yang sedang mengalami terapi peningkatan progestin dan lebih lanjut bisa terdiri dari tahapan untuk menyesuaikan terapi yang dimaksud untuk meningkatkan tingkat produksi cadherin-II, atau lebih jauh terdiri dari tahapan untuk menentukan waktu optimal bagi blastosis atau implantasi. Penentuan produksi cadherin-II bisa dibandingkan dengan sebuah standar sebagaimana disebutkan di atas.
Meski demikian, aspek lebih jauh dari temuan ini menunjukkan perbaikan kesuburan seorang wanita dengan meningkatkan ekspresi cad-II oleh endometrium, misalnya dengan menggunakan terapi gen.
Berdasarkan aspek ini, DNA yang mengkodekan cad-II yang terkait dengan urutan-urutan kontrol ekspresi bisa disalurkan atau ditransfer ke sel-sel endometrial melalui konstruk-konstruk DNA seperti vektor adenoviral.
Atau, teknik-teknik rekombinan homolog bisa digunakan untuk mentransfer kontrol ekspresi gen cad-II endogen ke urutan kontrol ekspresi berbeda. Yang juga diduga adalah penggunaan DNA pengkode cad-II untuk pembuatan sebuah obat untuk meningkatkan ekspresi cad-II dengan sel-sel endometrial melalui penyaluran DNA seperti ini ke sel-sel endometrial.
Urutan-urutan oligonukleotida yang bisa digunakan sebagai primer atau probe untuk urutan pengkodean cad-II, mRNA atau cDNA sebagaimana disebutkan disini telah diketahui sebelumnya telah dibuat dan digunakan untuk tujuan-tujuan tersebut. Informasi tentang urutan yang ditunjukkan dalam SEQ ID NO;1, atau dalam Tanihara dkk., supra, bisa langsung digunakan untuk membuat urutan-urutan oligonukleotida yang sesuai untuk digunakan pada temuan ini selain yang dijelaskan secara khusus dalam literatur sampai sekarang ini.
Produksi antibodi-antibodi terhadap cad-II dan hibriboma yang menghasilkan antibodi-antibodi monoklonal terhadap cad-II disebutkan pada contoh 10 berikut. Antibodi-antibodi terhadap cad-II juga bisa dibuat berdasarkan prosedur-prosedur yang telah ditentukan, khususnya prosedur-prosedur yang disebutkan dalam Paten A.S. No. 5.597.725 disamping menggunakan informasi urutan cDNA dalam SEQ ID NO;1, protein (atau sebuah fragmen imunogenik dari protein) yang didapatkan dari SEQ ID NO:1 atau urutan asam amino sesuai yang disebutkan dalam SEQ ID NO;4, atau informasi urutan yang disebutkan oleh Tanihara, dkk, supra.
Antibodi-antibodi monoklonal yang lebih dipilih disebut sebagai Cli-113E dan CII-113H, yang masing-masing dihasilkan oleh hidridoma yang dideposisikan oleh ICOS Corporation pada 21 April 1998 di American Type Culture Collection.
Salah satu hal dimana metode penemuan ini bisa dilakukan adalah dengan menguji keberadaan sebuah gen yang mengkodekan cad-II dalam setiap sampel jaringan seorang pasien yang cocok. Tidak adanya gen seperti ini atau adanya mutasi akan menandakan ketidakmampuan mendasar bagi pasien untuk mengekspresikan cad-II dalam jaringan manapun sehingga akan menjadi indikator kesuburan pasien tersebut. Ketika gen untuk cad-II bermutasi atau tidak ada, wanita yang bersangkutan mungkin tidak mampu menghasilkan atau mempertahankan kehamilan yang langgeng. Pada sebuah uji untuk keberadaan sebuah gen yang mengkodekan cad-II dalam DNA genomik, tidak jadi masalah bahwa sebuah sampel jaringan (seperti kulit, hapusan bukal, atau rambut) merupakan salah satu dimana ekspresi cad-Ii tidak terjadi pada orang dewasa. Metode ini mencakup hibridisasi (annealling) terhadap DNA genomik yang tercerna dari cDNA cad-II (seperti ditunjukkan pada SEQ ID NO:1, atau sebuah fragmen) dan pendeteksian DNA terhibridisasi berdasarkan prosedur yang telah ditentukan, termasuk yang disebutkan dalam Paten Amerika Serikat No. 5.597.725. Atau, mutasi-mutasi dalam gen yang mengodekan cad-II bisa dideteksi dengan menggunakan metode manapun yang diketahui, termasuk yang disebutkan dalam Eng dkk. Aspek lain dari penemuan ini adalah pendeteksian ekspresi/produksi cad-II dalam jaringan endometrial dari seorang pasien. Semua metode yang diketahui dalam literatur untuk pendeteksian RNA spesifik atau protein dari sebuah ekstrak seluler atau pada sebuah spesimen jaringan bisa digunakan. Sebagai contoh, setiap cara uji imunologi yang menggunakan antibodi anti-cad-II bisa dilakukan dengan menggunakan sebuah ekstrak selular atau sebuah spesimen jaringan (jika memungkinkan). Lebih disukai antibodi adalah antibodi monoklonal yang spesifik untuk cad-II.
Metode ini akan melibatkan sebuah sistem pendeteksian yang cocok dimana pengikatan antibodi ke cad-II dideteksi. Setiap sistem pendeteksian seperti ini yang mungkin diketahui dalam ltiteratur bisa digunakan, termasuk pemantauan produksi sebuah imunopresipitat, penggunaan antibodi berlabel, pemisahan elektroforesis dan pendeteksian kompleks antibodi-antiogen berlabel atau berwarna (seperti Western Blot), uji lapus antibodi, uji imunohistologi (termasuk imunohistokimia, imunofluoresensi), dan sitometri alir.
Metode penemuan ini yang menggunakan sebuah antibodi anti-cad-II bisa dilakukan pada spesimen-spesimen jaringan endometrial yang dibuat secara histologi. Uji imunohistokimia dan imunofluoresen khususnya bermanfaat untuk spesimen-spesimen histologi dan metodologi ini memungkinkan pendeteksian produksi cad-II yang terkait dengan sel-sel endometrial berbeda sehingga memungkinkan perbandingan antara sel-sel epitelium dan stromal. Prosedur-prosedur untuk pemisahan sel-sel epitelium dan stroma bisa digunakan sebelum metodologi yang cocok lainnya dari temuan ini yang melibatkan preparasi ekstrak-ekstrak seluler.
Intensitas imunostaining cad-II dalam biopsi endometrial bisa ditentukan dengan tekni HSCORE semikuantitatif yang rutin digunakan dalam oncology untuk jumlah sel kanker. HSCORE merupakan sebuah nilai kontinyu (dari 0-4, masing-masing), dimana sebuah tingkat diskriminasi yang diberi nilai positif dan negatif untuk tes ditentukan. Lazimnya, kesepakatan terbentuk antara jumlah yang dilakukan oleh dua pengamat dengan cara samar yang menggunakan mikroskop berkepala ganda pada pembesaran rendah dan tinggi.
Ekspresi cad-II tampak negatif atau lemah (HSCORe = -1) atau memiliki ekspresi tinggi (HSCORE = 3-4) dalam stroma dan epitelium endometrium sekretory. Sehingga, pada sebuah perbandingan tingkat produksi cad-II dari spesimen biopsi endometrial uji dengan tingkat produks cad-II dari spesimen biopsi endometrial standar dengan HSCORE 3-4 (seperti, dari subjek wanita subur dengan kemampuan untuk menghasilkan dan mempertahankan kehamilan, atau dari subjek wanita subur selama periode waktu dimana mereka bersikap terbuka terhadap implantasi blastosit), maka spesimen uji dengan HSCORE 0-2 menunjukkan bahwa subjek uji tidak mampu menghasilkan atau mempertahankan kehamilan.
Pengukuran ekspresi cad-II yang lebih detail dalam komponen epitelium atau stromal dari endometrium bisa diterapkan pada tes. Pada kondisi-kondisi ini, HSCORE akan dihitung dengan menggunakan persamaan berikut: E Pi (i + 1) dimana i = intensitas staining (0 = tidak ada staining; 1 = lemah; 2 = sedang; dan 3 = staining kuat) dan Pi adalah persentase sel epitelium atau stromal yang terstaining untuk masing-masing intensitas, yang bervariasi antara 0% sampai 100%. Disamping itu, analisis ROC bisa diterapkan pada pengukuran HSCORe. Kurva ROC menunjukkan hubungan antara rasio true-positive dan rasio false-positive sebagai definisi dari uji positif. Program komputer yang dibuat untuk tujuan ini (seperti program SAS) bisa digunakan untuk menentukan nilai HSCORE yang optimal untuk digunakan memprediksikan, misalnya, LPD.
Metode-metode statistik dimana sampel-sampel uji bisa dibandingkan dengan sebuah standar juga telah diketahui. Sebagai contoh, hasil dari uji imunologi seperti ELISA, atau hasil dari PCR, bisa dianalisis dan dibandingkan dengan sebuah standar melalui analisis teknik varians (ANOVA).
Metode penemuan ini juga mencakup pendeteksian mRNA cad-II dalam ekstrak-ekstrak seluler dari jaringan endometrial. Dengan menggunakan informasi urutan cDNA yang diketahui untuk cad-II, semua metode pendeteksian mRNA atau recovery cDNA dari mRNA bisa digunakan. Sebagai contoh, analisis Northern Blot terhadap ekstrak-ekstrak seluler bisa dilakukan dengan menggunakan cDNA cad-II sebagai probe. Demikian juga, informasi urutan cDNA cad-II memungkinkan pembuatan dan penggunaan primer-primer dimana cDNA dari mRNA cad-II bisa dibuat dengan transkripsi terbalik menggunakan prosedur-prosedur yang baku. cDNA seperti ini bisa dideteksi, direcovery, atau diamplifikasi dengan reaksi rantai polimerase (PCR) dan DNA teramplifikasi yang dihasilkan dideteksi dengan menggunakan prosedur-prosedur baku. Hibridisasi in situ terhadap sebuah probe oligonukleotida berlabel terhadap mRNA cad-II bisa digunakan dalam penemuan ini untuk mendeteksi mRNA cad-II dalam sebuah jaringan atau spesimen selular.
Metode-metode dari temuan ini bisa mencakup satu atau lebih tahapan untuk mendapatkan sebuah sampel jaringan dari seorang pasien, baik dengan mempersiapkan sebuah ekstrak selular dari sampel jaringan atau dengan membuat sebuah spesimen histologis dari sampel jaringan, dengan menentukan keberadaan mRNA cad-II atau cad-II berdasarkan prosedur yang dijelaskan di atas, dan, dengan membandingkan hasil-hasil dari penentuan dengan hasil dari penentuan sama yang dilakukan dengan menggunakan jaringan dari wanita subur yang diketahui atau populasi wanita subur yang diketahui. Perbedaan mencolok pada produksi cad-II endometrial seperti antara wanita subur dan wanita tidak subur atau wanita yang mengalami kebiasaan aborsi atau RSA, memungkinkan penentuan ketidakmampuan atau kemampuan pasien uji untuk menghasilkan atau mempertahankan sebuah kehamilan, dan bisa membantu dalam mendiagnosa wanita-wanita yang menderita kebiasaan aborsi atau RSA, wanita yang mengalami defisiensi fase luteal (LPD), dan wanita-wanita yang mengalami ketidaksuburan primer yang tidak diketahui penyebabnya.
Juga diperkirakan bahwa cad-II bisa dipecah dan dilepas ke dalam serum wanita, sehingga penentuan kadar cad-II dalam plasma atau serum sebelum atau selama kehamilan dengan menggunakan, misalnya, uji ELISA, bisa dikorelasikan dengan kadar ekspresi cad-II oleh endometrium, yang pada gilirannya berkorelasi dengan kemampuan wanita untuk menghasilkan dan mempertahankan sebuah kehamilan yang langgeng. Penelitian-penelitian terbaru telah menunjukkan bahwa E-cad terpecah dan dilepaskan ke dalam serum pasien kanker. Pemantauan kadar cad-II dalam serum bisa menjadi uji yang kurang invasif untuk penentuan kemampuan menghasilkan dan mempertahankan sebuah kehamilan.
Penemuan ini juga menjadi sebuah sarana untuk melakukan metode-metode yang disebutkan di atas. Sarana ini bisa mencakup instruksi-instruksi untuk penggunaannya dan informasi atau tampilan-tampilan bergambar yang memungkinkan perbandingan dilakukan antara seorang pasien uji dan hasil yang diharapkan dari seorang wanita subur. Sarana ini bisa mencakup reagen, substrat-substrat mekanis dan sejenisnya yang bermanfaat dalam kinerja dalam metode-metode yang disebutkan di atas. Sebagai contoh, sebuah sarana yang cocok untuk penentuan cad-II secara imunohistokimia dalam sebuah spesimen jaringan endometrial bisa mencakup komponen-komponen berikut dalam wadah: (1) antibodi primer (seperti antibodi monoklonal mencit) terhadap cad-II manusia; (2) antibodi sekunder terhadap antibodi monoklonal (seperti antibodi anti IgG mencit dari kuda yang terbiotinilasi); (3) serum pemblokir (seperti dari kuda); (4) gugus yang dapat dideteksi untuk antibodi sekunder (seperti streptavidin – kompleks enzim terbiotinilasi atau reagen-reagen yang cocok untuk tujuan ini seperti larutan Avidin DH dan horseradish peroksidase terbiotinilasi).
Sebuah alat untuk penentuan mRNA akan mencakup oligonukleotida-oligonulleotida yang cocok yang berhibridisasi menjadi mRNA cad-II dan berfungsi sebagai primer-primer transkripsi terbalik (RT) atau probe.
Alat ini bisa mencakup reagen-reagen standar untuk transkripsi terbalik yang mencakup transkriptase terbalik yang sesuai dan bisa mencakup primer-primer yang cocok dan/atau enzim-enzim untuk amplifikasi cDNA. Sebuah alat yang terdiri dari primer-primer RT untuk cDNA cad-II bisa hanya mencakup primer-primer tersebut, pengepakan komersial dan instruksi-instruksi dan ditujukan untuk digunakan.
Penyaluran gen cad-II fungsional ke sel-sel yang sesuai dipengaruhi secara in vivo atau ex vivo dengan penggunaan vektor, dan lebih khusus lagi vektor virus, atau dengan penggunaan metode-metode transfer DNA. Atau, sel-sel endometrial bisa dimodifikasi untuk mengaktivasi gen cad-II endogen yang tidak normalnya diekspresikan atau sedang diekspresikan dengan jumlah rendah dibanding yang diharapkan. Modifikasi yang cocok bisa mengganti seluruh atau sebagian promoter cad-II yang terbentuk secara alami dengan sebagian atau semua dari promoter heterolog, misalnya dengan sebuah cara yang memungkinkan kontrol ekspresi cad-II dengan alat-alat eksternal.
Perwujudan tertentu yang mengilustrasikan temuan ini disebutkan pada beberapa contoh berikut ini.
Contoh 1:
Menguji produksi cad-II endometrial sebelum dan setelah pengobatan hormon tertentu (progesteron) pada wanita yang memiliki kebiasaan aborsi yang terkait dengan defisiensi fase luteal.
Ekspresi Cadherin-II pada wanita yang mengalami kebiasaan aborsi yang terkait dengan hormonal dalam penelitian ini didefinisikan sebagai tiga atau lebih keguguran spontan berturut-turut. Sampai sekarang ini, biopsi endometrial dianggap sebagai metode yang paling terpercaya dalam menentukan kemungkinan implantasi dan kehamilan dini. Akan tetapi, banyaknya perbedaan diantara patologist dan keakuratan rendah menunjukkan bahwa teknik ini tidak lagi dapat diterima. Ekspresi/produksi cad-II merupakan sebuah penanda yang sangat baik.
Keberadaan cad-II diuji pada biopsi-biopsi endometrial yang didapatkan dari wanita yang memiliki kebiasaan aborsi dalam kaitannya dengan defisiensi fase luteal (LPD). Kelompok wanita ini, yang mewakili sekitar 20% dari wanita yang mendatangi rumah sakit di Loss Clinic, B.C. Women's Hospital and Health Center, University of British Columbia, Vancouver, Canada, secara rutin diobati dengan progesteron atau clomifen sitrat. Spesimen-spesimen biopsi didapatkan dari wanita-wanita ini sebelum dan setelah pengobatan. ekspresi/produksi cad-II berkorelasi dengan hasil kehamilan selama pengobatan. Pengobatan LPD kali ini terdiri dari suppositori progesteron vaginal atau clomifen sitrat, dengan dosis yang disesuaikan sampai biopsi endometrial berulang dianggap “normal” melalui penilaian morfologis.
LPD didiagnosa dengan metode-metode tradisional sebelum menentukan cad-Ii dengan imunostaining. Untuk meningkatkan kemungkinan memasukkan individu-individu yang mengalami LPD autentik saja, kriteria inklusi dalam penelitian ini adalah dua biopsi berturut-turut dengan 2-3 hari penundaan pematangan berdasarkan hari pertama dari menstruasi selanjutnya sebagaimana ditentukan dengan penilaian morfologis.
Contoh 2.
Protokol sitometri alir untuk mendeteksi keberadaan cad-II pada permukaan sel-sel endometrial.
Jaringan-jaringan untuk sitometri alir didapatkan dalam fase folikular atau fase luteal dari siklus menstruasi, dengan menggunakan sampel endometrial. Sampel-sampel ditempatkan dalam sebuah medium steril (DMEM) yang disuplementasi dengan 10% serum anak sapi, 2% L-glutamin dan 1% penicillin-streptomysin. Sel-sel epitelium dan stromal diisolasi berdasarkan prosedur yang ada.
Sampel kontrol positif dari endometrium dicairkan untuk setiap sampel uji. Sebanyak empat tabung uji dibuat untuk masing-masing sampel uji. Sebuah studi rentang referensi bisa dilakukan, dengan menggunakan kontrol subur yang sehat, untuk menentukan persentil 2,5 bawah dari kurva distribusi.
Sampel-sampel endometrial disitosentrifugasi dan disuspensi dalam larutan garam normal. IgG kambing, 50 yl dari pengenceran 1/200 ditambahkan ke masing-masing enam tabung uji.
Tabung-tabung uji dipra-inkubasi pada 40oC selama 15 menit dan dicuci 2 kali dengan 2 mL PBS yang mengandung 0,1 k sdioum azida (NaN3) dan 1% FCS diikuti dengan sentrifugasi pada 400 xg pada suhu kamar selama 10 menit. Lapisan teratas didekantasi sehingga menyisakan sebuah pil sel kering pada dasar masing-masing tabung.
Untuk mengidentifikasi sel-sel glandular, 10 yl pengenceran optimal, yang ditentukan dengan titrasi serial dua kali dari masing-masing lot, dari antibodi monoklonal sitokeratin anti-manusia mencit (PE) tekronyugasi fikoerithrin ditambahkan ke dua dari empat tabung uji pada masing-masing kelompok. Untuk mengidentifikasi sel-sel stromal, 5 yl dari pengenceran optimal dari antibodi monoklonal 5B5 anti-manusia mencit PE ditambahkan ke tiga tabung uji lainnya pada masing-masing kelompok. Untuk mengidentifikasi keberadaan cadherin-II pada permukaan sel glandular atau sel stroma, 100 yl dari pengenceran optimal fragmen-fagmen F(ab')2 FITC dari antibodi monoklonal cadherin anti-manusia mencit dibuat dengan menggunakan alat preparasi IMMUNOPURETM Fab, ditambahkan ke empat tabung uji. Sebanyak 12 tabung kemudian diinkubasi selama 30 menit pada suhu 40oC.
Sel-sel dicuci dua kali dengan 2 mL PBS yang mengandung 0,1k NaN3 dan 1% FCS diikuti dengan sentrifugasi, pada 400 xg pada suhu kamar selama 10 menit. Lapisan teratas didekantasi sehingga menyisakan pil sel kering pada dasar setial tabung. Sel-sel diikat dalam 0,3 mL paraformaldehida 1%.
Sampel-sampel dianalisis dengan menggunakan sitometri alir EPICS Profile ITM. Data dikumpulkan dengan amplifikasi logaritmik, dan intensitas fluoresensi ditampilkan pada sebuah channel 256, skala log empat dekade.
Untuk masing-masing tabung, sebuah gerbang elektornik dibuat secara manual di sekitar populasi sampel. Fluroesensi pikoerithrin (PE) dari 10.000 sel dari dalam peta diplotkan pada sebuah histogram parameter, pada channel 265, skala log empat dekade. Sebuah gerbang jendela digambar lintas populasi sel positif PE. Fluoresensi FITC dalam gerbang jendela PE diplotkan terhadap sebuah histogram parameter tunggal, pada channel 256, skala log empat dekade. Sebuah kursor digambar lintas sumbu-x untuk menentukan fluoresensi FITC channel rata-rata logaritmik. Dengan menggunakan tabel yang disuplai oleh perusahaan yang membuat, fluoresensi saluran mean logaritmik dikonversi menjadi fluoresensi saluran mean linear. Pergeseran channel diselesaikan dengan mengurangi fluoresensi saluran mean linear dari kontrol negatif dengan sampel uji.
Judul Asli: Cadherin 11 As an Indicator of Viable Pregnancy
Penulis: Anonymous
Tahun: 2008
Sumber: http://www.wipo.intpctdbenwo.jspIA=CA1998000397&DISPLAY=DESC
Kata kunci:
Comments
Post a Comment