Proteksi kulit dari kerusakan akibat radiasi ultraviolet dengan menggunakan sebuah larutan antioksidan topikal yang mengandung vitamin C dan E dan distabilkan dengan asam ferulat
Abstrak
Latar belakang: Kanker kulit dan fotoaging (penuaan kulit akibat sinar matahari) disebabkan oleh tekanan oksidatif imbas ultraviolet (UV). Antioksidan-antioksidan topikal bisa melindungi kulit dari efek-efek ini.
Tujuan: Menentukan apakah sebuah formulasi topikal stabil yang terdiri dari asam L-askorbat 15%, alfa-tokoferol 1%, dan asam ferulat 0,5% (CEFer) bisa melindungi kulit manusia dari radiasi UV simulasi matahari (in vivo).
Metode: CEFer dan wahananya diaplikasikan ke bidang-bidang terpisah dari kulit manusia yang tampak normal selama 4 hari. Masing-masing bidang kulit diradiasi dengan sinar UV simulasi matahari, 2 sampai 10 MED (dosis eritema minimal), pada interval 2-MED. Satu hari kemudian, kulit diperiksa untuk eritema dan sel-sel lecur-surya (sunburn), dan dengan teknik munohistokimia untuk pemeriksaan dimer thymin dan p53. Pembentukan sitokin imbas UV, termasuk interleukin (IL)-α, IL-6, IL-8, dan IL-10, dan faktor nekrosis tumor-α, dievaluasi dengan menggunakan teknik PCR (reaksi rantai polimerase) real-time.
Hasil: CEFer memberikan proteksi dari cahaya yang signifikan bagi kulit dengan semua metode yang dievaluasi.
Kekurangan: Jumlah pasien yang dievaluasi relatif kecil.
Kesimpulan: CEFer memberikan perlindungan kulit yang signifikan dari cahaya. Formulasi ini khususnya efektif untuk mengurangi mutasi-mutasi dimer thymin yang diketahui terkait dengan kanker kulit. Mekanisme aksinya berbeda dengan sunscreen dan diharapkan dapat menambah proteksi matahari yang diberikan oleh pemakaian sunscreen.
Radiasi ultraviolet (UV) dalam sinar matahari menghasilkan tekanan oksidatif pada kulit yang bisa menyebabkan kanker kulit dan perubahan fotoaging. Kulit melindungi dirinya sendiri dengan menggunakan antioksidan-antioksidan berberat-molekul rendah yang menetralisir tekanan oksidatif sebelum bisa menyebabkan kerusakan. Kebanyakan proteksi oleh antioksidan tergantung pada asupan makanan dan penyalurannya ke kulit. Karena antioksidan dimusnahkan atau dirubah melalui oksidasi selama netralisasi, maka proteksi sering dibatasi oleh konsentrasi kecil antioksidan yang tinggal pada kulit. Dalam upaya untuk mendukung strategi protektif ini, laboratorium kami tertarik untuk mengembangkan penggunaan antioksidan secara topikal untuk fotoproteksi. Untuk mencapai hal ini, diperlukan untuk membuat sebuah formulasi yang memungkinkan stabilitas zat-zat yang tidak stabil ini. Yang lebih penting lagi, diperlukan untuk mencari formulasi yang memungkinkan antioksidan-antioksidan ini masuk ke dalam kulit, sehingga berada pada lokasi yang tepat untuk memberikan proteksi.
Dengan menggunakan kulit babi sebagai sebuah model untuk kulit manusia, kami telah menemukan bahwa asam L-askorbat 15%, yang diprotonasi untuk menghilangkan muatan, mampu menembus kulit dan melindunginya dari radiasi UV. Setelah memaksimalkan konsentrasi larutan untuk mencapai efektifitas tertinggi, kami menunjukkan bahwa konsentrasi pada kulit, jika telah jenuh, akan menjadi stabil dengan waktu-paruh penghilangan sekitar 4 hari. Produk topikal generasi pertama ini memberikan proteksi terhadap UVB dan UVA. Karena larutan ini tidak memiliki absorpsi terhadap panjang-panjang gelombang ini (UVA dan UVB), maka disimpulkan bahwa proteksi tidak disebabkan oleh efek sunscreen. Disamping itu, larutan ini melindungi imunosupresi imbas UV. Asam L-askorbat topikal menambah konsentrasi senyawa ini yang telah ada pada kulit dan kemungkinan besar menambah efek antioksidannya.
Selanjutnya kami mengkombinasikan asam L-askorbat 15% dengan α-tokoferol 1%. Antioksidan-antioksidan ini membentuk sebuah pasangan interaktif dalam jaringan. Ketika α-tokoferol menetralisir tekanan oksidatif pada lipid, produk oksidasinya bisa dihasilkan oleh asam L-askorbat. Interaksi ini membantu memperbaharui proteksi antioksidan dalam jaringan. Setelah memaksimalkan konsentrasi dan stabilitas larutan, produk generasi-kedua ini memberikan perlindungan yang dua kali lipat bagi kulit, dibanding dengan asam L-askorbat saja.
Baru-baru ini, kami telah melakukan sebuah penelitian untuk mencari antioksidan-antioksidan yang bisa meningkatkan stabilitas larutan asam L-askorbat dan α-tokoferol. Kami menemukan bahwa penambahan asam ferulat 0,5%, sebuah antioksidan tanaman yang umum, dapat meningkatkan stabilitas dan menambah kapasitas proteksi dari UV bagi kulit. Asam ferulat, sebuah asam hidroksinamat, kemungkinan melindungi asam L-askorbat dan α-tokoferol dalam larutan dengan cara berfungsi sebagai substrat yang dikorbankan. Kami menunjukkan bahwa kombinasi antioksidan ini memberikan proteksi yang lebih baik dibanding jika tidak dikombinasikan. Efek ini jelas tidak terkait dengan efek sunscreen. Dalam artikel ini kami memaparkan perluasan pengamatan-pengamatan ini pada kulit manusia. Kami menunjukkan bahwa produk generasi-ketiga ini (kombinasi asam L-askorbat 15%, α-tokoferol 1% dan asam ferulat 0,5%) memberikan fotoproteksi UV yang efektif, menghambat pembentukan dimer thymin, dan menghambat aktivasi p53. Disamping itu, aktivasi interleukin (IL)-α, IL-6, IL-8, IL-10, dan TNF-α oleh sinar UV dapat dikurangi.
METODE
Protokol eksperimental
Penelitian dilakukan dengan persetujuan dari badan review institusi kami. Sembilan orang dewasa yang memiliki kulit tipe II atau III (kulit putih dengan kemampuan menyamak ringan sampai sedang pada saat merespon terhadap sinar UV) dimasukkan dalam eksperimen. Dua larutan diaplikasikan (2 mg/cm2) setiap hari selama 4 hari ke bagian-bagian kulit punggung yang terpisah. Semua subjek diinstruksikan untuk tidak mencuci bagian yang diolesi selama sekurang-kurangnya 2 jam. Salah satu larutan adalah larutan cair yang mengandung asam askorbat 15%, dl-α tokoferol 1%, dan asam trans ferulat 0,5% (CEFer). Larutan lain adalah wahana/plasebo. Kedua larutan (C E Ferulat dan wahananya) diperoleh dari perusahaan SkinCeuticals (Garland, Tex). Pada hari ke-3, masing-masing subjek mendapatkan radiasi tersimulasi matahari ke bagian-bagian kulit yang tidak diperlakukan, untuk menentukan dosis eritema minimal (MED). Radiasi berkisar antara 20 sampai 60 mJ/cm2 pada interval UVB 10-mJ/cm2 sebagaimana diukur dengan radiometer (IL1700, International Light, Newburyport, Miss). MED ditentukan 24 jam kemudian sebagai dosis terendah yang menghasilkan batas-batas eritema yang tepat dapat dilihat (sekitar 40 mJ/cm2). Rincian radiasi telah dipublikasikan dalam penelitian lain. Simulator matahari xenon 1000-W (Lightning Cure 200, Hamamatsu City, Jepang) dikombnasikan dengan sebuah sebuah cermin dikroik untuk menyaring sinar inframerah dan sinar tampak dan filter bandpass 292 Schott (Mainz, Jerman) untuk menghilangkan panjang gelombang yang kurang dari 294 nm dipasangkan dengan sebuah pandu cahaya cair untuk membuat titik cahaya 1 cm pada kulit yang digunakan pada output sekitar 5 mW/cm2 UVB dan sekitar 40 wM/cm2 UVA. Pada hari ke-4, bagian yang diperlakukan dengan wahana/plasebo mendapatkan 2 sampai 6x MED dan bagian yang diperlakukan dengan CEFer mendapatkan 2 sampai 10x MED, masing-masing pada interval 2x-MED. Satu hari selanjutnya, kulit diperiksa dengan kolorimetri untuk eritema, dan spesimen biopsi jarum 4-mm dari kulit yang mendapatkan MED radiasi 6x dievaluasi untuk sel-sel sunburn.
Pengukuran eritema dan sel-sel lecur-surya (sunburn)
Eritema diukur dengan kolorimetri komputer dalam sebuah fotograf kulit warna digital mode ”a”. Masing-masing titik dan kulit sekitarnya yang tidak diradiasi diukur tiga kali. Perbedaan warna antara kulit yang disinari dan yang tidak disinari menentukan eritema. Sel-sel lecur-surya ditentukan pada irisan-irisan kulit terikat formalin yang distaining dengan hematoksisilin dan eosin. Hasilnya dinyatakan sebagai nilai mean ± SD. Nilai P ditentukan dengan uji t Student two-tailed dengan menggunakan varians yang tidak seimbang.
Imunohistokimia untuk dimer thymin dan p53
Dimer thymin. Irisan-irisan jaringan yang ditanam dalam parafin dan terikat formalin dideparafinisasi dengan xylen dan direhidrasi melalui serangkaian air alkohol bermutu. Irisan-irisan mengalami pemulihan epitop imbas panas dengan menginkubasinya dalam sebuah larutan buffer sitrat (pH 6,0) (Zymed, San Fransisco, Calif) selama 20 menit pada suhu 95oC, diikuti dengan ekuilibrasi dalam larutan garam berbufer fosfat (PBS). Peroksidase non-spesifik diblokir oleh hidrogen peroksida 3%, dan pengikatan non-spesifik dihambat dengan serum kuda 1,5% pada PBS. Klon antibodi dimer antithymin monoklonal mencit KTM-53 (Kamiya Biomedical, Seattle, Wash) diencerkan dalam serum kuda 1,5%-PBS menjadi 1/1000 dan diinbukasi pada irisan-irisan selama 1 jam pada suhu 37oC. Pendeteksian dicapai dengan antibodi sekunder anti-mencit kuda dengan menggunakan avidin-biotin-link sebagaimana dijelaskan oleh penyuplai. Slide-slide dikounterstaining dengan hematoxylin.
P53. Prosedurnya identik dengan yang dijelaskan di atas, kecuali bahwa pemulihan antigen dilakukan dengan pemulihan epitop imbas panas pada buffer pH8 Tris-EDTA (Zymed). Pendeteksian dicapai dengan klon p53 anti-manusia monoklonal mencit DO-7 (Dako, Glostrup, Denmark) yang diencerkan dalam serum kuda 1,5%-PBS menjadi 1/250.
Kajian PCR (reaksi rantai polimerase) real-time
Kajian identik dilakukan pada 10 subjek tambahan dengan pengecualian subjek yang mendapatkan penyinaran pada 2x MED. Spesimen-spesimen biopsi 6-mm dari kulit yang diperlakukan CEFer dan yang diperlakukan dengan wahana/plasebo dibagi dua, setengah untuk analisis PCR dan setengah untuk imunohistokimia.
Pengisolasian RNA duta dari spesimen-spesimen biopsi kulit
Spesimen-spesimen biopsi kulit yang tidak diperlakukan, yang diperlakukan dengan UV + wahana/plasebo, dan yang diperlakukan UV + CEFer dari masing-masing subjek langsung dimasukkan dalam RNALater (Qiagen, Valencia, Calif) dan disimpan pada suhu -80oC sampai pemrosesan bisa dilakukan. Total RNA diekstrak dengan menggunakan mini kits jaringan berserat (RNeasy, Qiagen). Jaringan dihomogenisasi dalam bufer RLT dengan menggunakan sebuah homogenizer jaringan (Omni International, Bethesda, Md) dan RNA diisolasi berdasarkan protokol alat (Qiagen). Untuk menghindari DNA genomik pengkontaminasi, Dnase yang bebas-Rnase (Qiagen) digunakan. Konsentrasi RNA diukur dengan spektrofotometer dan disimpan pada suhu -82oC dalam air. Untuk sintesis DNA komplementer (cDNA), sekitar 2 µg dari RNA total ditranskripsi dengan reagen-reagen transkripsi cDNA menggunakan heksamer acak. Parameter penyiklus termal mencakup 5 menit pada 25oC selama inkubasi, 30 menit pada 42oC untuk reaksi RT, dan 5 menit pada 85oC untuk inaktivasi enzim. cDNA dimurnikan dengan alat pemurni PCR (QiaQuick, Qiagen) dan kemudian disimpan dalam bufer elusi pada suhu -82oC sampai PCR RT kuantitatif dilakukan.
PCR kuantitatif RT
Pengukuran ekspresi gen dilakukan dengan menggunakan sistem PCR RT sebagaimana dijelaskan sebelumnya. Probe TaqMan diberi label pada ujung-5' dengan molekul zat warna reporter FAM (6-karboksifluoresein; emisi λmaks = 518 nm) dan pada ujung-3' dengan molekul zat warna quencher 3' Black Hole Quencher (absorbansi λmaks = 534 nm). Reaksi PCR RT dari spesimen-spesimen cDNA dan standar cDNA dilakukan dalam total volume 25 μL dengan 2X iQ SuperMix (BioRad) dan primer-primer dan probe-probe pada konsentrasi optimum. Parameter-parameter untuk penyiklus termal adalah 3 menit pada suhu 95oC, dan 40 siklus yang melibatkan denaturasi pada 95oC selama 30 detik, pendinginan/ekstensi pada 59oC selama 30 detik. Pemantauan RT untuk emisi fluoresensi dari pembelahan probe-probe spesifik urutan dengan aktivitas nuklease dari polimersae taq memungkinkan definisi siklus ambang batas selama fase eksponensial amplifikasi.
Untuk analisis kontrol 18S RNA, IL-1α, IL-6, IL-8, IL-10, dan ekspresi RNA duta TNF-α, sebuah kurva standar dibuat dengan pengenceran cDNA berurutan yang didapatkan dari sampel tunggal sel mononuklear darah perifer manusia yang telah distimulasi selama 4 jam dengan fitohemagglutinin (5 μg/mL). Sel-sel dihilangkan, mRNA diisoasi, dan cDNA dihasilkan sebagaimana dijelaskan di atas. Perhitungan relatif ekspresi mRNA sitokin ditentukan dengan menggunakan metode kurva standar relatif. Masing-masing hasil dinormalisasi dengan menggunakan RNA ribosomal 18S sebagai sebuah kontrol internal dengan primer dan probe spesifik 18S. Semua sampel, yang dianalisis dengan PCR RT, diulangi tiga kali. Ekspresi mRNA sitokin diekspresikan sebagai unit-unit acak. Rasio antara ekspresi mRNA kulit yang diperlakukan dengan UV-CEFer dan kulit yang diperlakukan dengan UV-wahana/placebo x 100 ditentukan untuk mengevaluasi persen penekanan ekspresi mRNA sitokin untuk masing-masing sitokin yang diuji.
Desain primer dan probe sitokin
Primer-primer oligonukleotida dan probe TaqMan untuk 18S, IL-1α, IL-8, dan IL-10 didesain dengan menggunakan PrimerRQuest (Integrated DNA Technologies). Kami melakukan pencarian BLASTN untuk menguatkan total spesifitas gen dari urutan-urutan nukleotida yang dipilih untuk primer dan probe dan ketiadaan polimorfisme DNA. Untuk menghindari amplifkasi DNA genomik pengkontaminasi, salah satu dari dua primer untuk cDNA ditempatkan pada pertemuan antara dua ekson atau dalam ekson yang berbeda. Primer-primer sitokin dirancang untuk menghasilkan amplikon yang kurang dari 150 pasangan basa untuk meningkatkan efisiensi amplifikasi PCR. Set ekspresi gen untuk IL-6 dan TNF-α dibeli dari perusahaan Applied Biosystems.
Analisis statistik
Hasil dianalisis menggunakan uji Mann-Whitney dan uji Wilcoxon menggunakan software (Analyse-it, Analyse-It Software Ltd, Leeds, United Kingdom). Signifikans statistik diasumsikan untuk nilai P yang kurang dari 0,05.
HASIL
Eritema
CEFer memberikan proteksi yang signifikan terhadap eritema imbas UV jika dibandingkan dengan kulit yang diperlakukan dengan wahana/plasebo (Gbr. 1 dan 2). Pada radiasi 2 sampai 6x MED, pembacaan kolorimeter untuk wahana/plasebo berbanding CEFer menunjukkan proteksi yang signifikan (P < 0,01) oleh CEFer pada semua tingkat radiasi (Gbr. 2). Lebih daripada itu, CEFer memberikan proteksi yang signfiikan (P < 0,01) pada radiasi 8x MED dan 10x MED jika dibandingkan dengan kulit yang diperlakukan wahana/placebo yang diradiasi dengan 6X MED.
Sel-sel lecur-surya (sunburn)
Pengidentifikasian sel lecur-surya (gbr. 3) pada kulit yang diradiasi dengan 6X MED jika dibandingkan dengan kulit yang diperlakukan wahana/placebo dengan tingkat radiasi sebanding menunjukkan proteksi yang signifikan (P < 0,01) oleh CEFer, (wahana/plasebi 31,5 ± 14,3 berbanding CEFer 8,3 ± 7).
Dimer thymin dan p53
Imunohistokimia kulit yang mendapatkan radiasi 2x MED menunjukkan proteksi yang hampir sempurna oleh CEFer, ketika dibandingkan dengan wahana/plasebo, terhadap pembentukan dimer thymin dalam DNA (Gbr. 4) dan terhadap induksi p53 (Gbr. 5).
Ekspresi mRNA sitokin
Ekspresi mRNA sitokin meningkat pada kulit yang diperlakukan wahana/placebo yang diradiasi UV ketika dibandingkan dengan kulit normal yang tidak diradiasi untuk semua sitokin yang diuji. Ini signifkan untuk semua sitokin (P < 0,05, Uji Wilcoxon signed rank, 2-tailed). Kulit yang diperlakukan dengan wahana/plasebo yang disinari dengan UV menunjukkan peningkatan ekspresi mRNA, rasio rata-rata UV wahana/tidak ada UV IL-1α (7,2), IL-6 (245), IL-8 (275), IL-10 (5,6), dan TNF-α (2,5). Perlakuan dengan CEFer menghasilkan penekanan ekspresi mRNA sitokin yang signifikan secara statistik (P < 0,05) untuk semua sitokin kecuali TNF-α (P = 0,654, uji signed rank Wilcoxon, 1-tailed). Perlakuan dengan CEFer menghasilkan penekaan rasio rata-rata ekspresi mRNA sitokin dari IL-1α (2,2), IL-6 (25,8), IL-8 (42,1), IL-10 (5,6), dan TNF-α (0,8). Penekanan berksiar mulai dari 16,4% untuk TNF-α sampai 89,6% untuk IL-8 (Gbr. 6).
PEMBAHASAN
Penelitian ini menunjukkan bahwa kombinasi antioksidan fisiologis, vitamin C dan E, yang distabilkan oleh sebuah antioksidan tanaman, asam ferulat, bisa diaplikasikan secara topikal ke kulit dan menambah antioksidan alami pada kulit untuk melindunginya dari kerusakan oksidatif yang ditimbulkan sinar UV. Disamping melindungi kulit dari eritema dan apoptosis yang terkait dengan kerusakan seluler, proteksi juga diberikan terhadap mutasi-mutasi DNA imbas UV yang telah dibuktikan terkait dengan kanker kulit.
Radiasi UV menghasilkan spesies oksigen reaktif pada kulit yang bisa mengoksidasi asam-asam nukleat, protein, dan lipid, reaksi-reaksi yang tergantung pada kedekatan dengan spesies pengoksidasi. Dari waktu ke waktu perubahan-perubahan ini menghasilkan fotoaging dan kanker. Lebih dari 90% radiasi UV dalam sinar matahari adalah UVA, dan UVA lebih berperan dibanding UVB untuk menimbulkan tekanan oksidatif pada kulit. UVA menghasilkan oksigen tunggal pada kulit yang selanjutnya menghasilkan spesies oksigen reaktif termasuk radikal bebas. Sunscreen memberikan proteksi yang sangat efektif bagi kulit terhadap UVB dan lecur-surya (sunburn), tetapi proteksi terhadap UVA dan efeknya tidak sempurna. Tidak ada zat kimia sunscreen yang memberikan proteksi terhadap UVA gelombang-panjang di atas sekitar 390 nm. Proteksi sunscreen tergantung pada pengaplikasian yang cermat dan bisa terlepas oleh keringat, penggarukan dan degradasi akibat sinar matahari. Bahkan sunscreen yang terbaik sekalipun hanya mampu memblokir tidak lebih dari setengah pembentukan radikal bebas imbas UV pada kulit. Sebaliknya, antioksidan bekerja dari dalam kulit. Antioksidan tidak bisa terlepas dengan pencucian dan penggarukan kulit. Jika sudah berada dalam kulit, antioksidan menjadi stabil dan bisa memberikan proteksi selama beberapa hari.
Formulasi CEFer yang digunakan dalam penelitian ini telah dimaksimalkan untuk absorpsi perkutaneous dan fotoproteksi untuk kulit. Antioksidan-antioksidan dalam tubuh bekerja seimbang. Peningkatan salah satu antioksidan biasanya hanya menghasilkan efek sedang. Konsentrasi antioksidan yang seimbang dalam CEFer memberikan dukungan interaktif yang menghasilkan proteksi sinergis. Ada banyak antioksidan yang telah ditemukan memberikan perlindungan terhadap cahaya untuk sistem-sistem seluler dan sistem in vitro tetapi ketika diujicoba secara in vivo gagal karena tidak mampu menembus kulit. Karena antioksidan merupakan spesies yang sangat tidak stabil, maka turunan-turunannya telah disintesis untuk memberikan stabilitas. Sehingga, asam L-askorbat telah distabilkan menjadi askorbil-6-palmitat dan magnesium askorbil fosfat, dan α-tokoferol telah distabilkan menjadi tokoferol asetat atau succinat. Turunan-turunan ini banyak digunakan dalam produk-produk kulit topikal. Turunan-turunan ini memberikan stabilitas untuk antioksidan dan bermanfaat untuk pil-pl vitamin A dimana konversi menjadi antioksidan asli terjadi dalam perut. Akan tetapi, pada kulit, konversi ini tidak efisien dan sedikit sekali antioksidan yang terdapat pada kulit.
Masih belum jelas mengapa antioksidan-antioksidan dapat mempengaruhi pembentukan dimer thymin imbas UV. Sebuah penelitian terbaru terhadap karsinoma sel skuamus pada kulit dan aktinik keratosis menunjukkan mutasi dimer thymin yang banyak dalam tumor-tumor ini. Walaupun pembentukan mutasi-mutasi dimer thymin telah dianggap disebabkan oleh absorpsi UVB langsung dan tidak terkait dengan oksidasi, namun penelitian-penelitian terbaru telah menunjukkan mutasi-mutasi dimer thymin yang melimpah pada kulit yang dihasilkan oleh radiasi UVA walaupun UVA hanya sedikit diserap oleh DNA. Lebih dari pada itu, struktur kulit secara efisien mencegah penetrasi UVB dan melindungi lesi-lesi DNA imbas UVB, tetapi hanya sedikit melindungi lesi-lesi DNA imbas UVA. UVA lebih banyak menghasilkan tekanan oksidatif pada kulit dibanding dengan UVB. Antioksidan-antioksidan baru-baru ini telah ditunjukkan efektif menghambat dimer siklopyrimidin imbas UVB pada sel HaCaT manusia tetapi tidak pada DNA telanjang. Data ini menunjukkan adanya reaksi fotosensitisasi seluler yang melibatkan mekanisme transfer energi tiga-kali-lipat, yang menghasilkan pembentukan dimer pyrimidin. Disamping itu, UVA bisa menghambat enzim-enzim reparasi DNA, sehingga memungkinkan dimer-dimer thymin terus tidak tereparasi dan masuk ke dalam replikasi DNA.
P53 diinduksi oleh radiasi UV pada saat merespon terhadap kerusakan DNA dan tekanan oksidatif. P53 menyebabkan sel memperlambat replikasi DNA dan pembelahan sel selanjutnya sehingga memungkinkan sel memerlukan lebih banyak waktu untuk reparasi kerusakan DNA. Pengurangan induksi p53 oleh CEFer dalam penelitian ini bisa dikaitkan dengan proteksi kerusakan DNA dan reduksi tekanan oksidatif yang ditimbulkan oleh antioksidan.
Radiasi UV telah terbukti meningkatkan produksi sitokin dalam epidermis, dan produksi sitokin ini dianggap memegang peranan penting dalam respons inflammatory yang terkait dengan kerusakan UV dan dalam imunosupresi lokal selanjutnya. Radiasi UV telah diketahui meningkatkan sitokin-sitokin pro-inflammatory seperti IL-1, IL-6, IL-8, dan TNF-α dan meningkatkan sitokin imunosupresi IL-10. Penelitian-penelitian pada hewan telah menunjukkan bahwa produksi IL-10 lokal penting dalam pengendalian karsinogenesis imbas-UV pada mencit. Radiasi UV telah terbukti menghasilkan aktivasi reseptor faktor pertumbuhan epidermal yang tergantung ligan, resetor TNF-α, dan reseptor IL-1 disertai respons-respons yang menurun mencakup ekspresi gen-gen teregulasi NF-kB, termasuk banyak sitokin. Mekanisme aktivasi imbas UV ini belum diketahui tetapi telah diduga bahwa spesies oksigen reaktif bisa memegang peranan dalam proses ini. Kami telah menunjukkan bahwa CEFer, sebuah antioksidan topikal, mampu mengurangi ekspresi sitokin proinflammatory dan imunospresif secara signifikan yang terjadi menyertai kerusakan akibat UV. Penekanan sitokin-sitokin ini bisa memegang peranan penting dalam mengurangi inflamasi dan imunosupresi yang terkait dengan keterpaparan UV. Penelitian-penelitian lebih lanjut masih diperlukan untuk menentukan apakah aktivasi reseptor faktor pertumbuhan epidermal, reseptor TNF-α, dan reseptor IL-1 imbas UV dan pensinyalan selanjutnya dihambat oleh CEFer.
CEFer telah dibuat secara bertahap untuk memberikan fotoproteksi antioksidan yang maksimal bagi kulit. Antioksidan melindungi kulit dengan menetralisir spesies oksigen reaktif sebelum bisa merusak kulit. Walaupun penelitian ini memberikan informasi hanya tentang proteksi terhadap cedera UV akut, namun bisa diharapkan bahwa proteksi yang terus menerus bisa mencegah cedera UV kronis dari waktu ke waktu. Antioksidan topikal bekerja melalui mekanisme yang berbeda dengan sunscreen.
Latar belakang: Kanker kulit dan fotoaging (penuaan kulit akibat sinar matahari) disebabkan oleh tekanan oksidatif imbas ultraviolet (UV). Antioksidan-antioksidan topikal bisa melindungi kulit dari efek-efek ini.
Tujuan: Menentukan apakah sebuah formulasi topikal stabil yang terdiri dari asam L-askorbat 15%, alfa-tokoferol 1%, dan asam ferulat 0,5% (CEFer) bisa melindungi kulit manusia dari radiasi UV simulasi matahari (in vivo).
Metode: CEFer dan wahananya diaplikasikan ke bidang-bidang terpisah dari kulit manusia yang tampak normal selama 4 hari. Masing-masing bidang kulit diradiasi dengan sinar UV simulasi matahari, 2 sampai 10 MED (dosis eritema minimal), pada interval 2-MED. Satu hari kemudian, kulit diperiksa untuk eritema dan sel-sel lecur-surya (sunburn), dan dengan teknik munohistokimia untuk pemeriksaan dimer thymin dan p53. Pembentukan sitokin imbas UV, termasuk interleukin (IL)-α, IL-6, IL-8, dan IL-10, dan faktor nekrosis tumor-α, dievaluasi dengan menggunakan teknik PCR (reaksi rantai polimerase) real-time.
Hasil: CEFer memberikan proteksi dari cahaya yang signifikan bagi kulit dengan semua metode yang dievaluasi.
Kekurangan: Jumlah pasien yang dievaluasi relatif kecil.
Kesimpulan: CEFer memberikan perlindungan kulit yang signifikan dari cahaya. Formulasi ini khususnya efektif untuk mengurangi mutasi-mutasi dimer thymin yang diketahui terkait dengan kanker kulit. Mekanisme aksinya berbeda dengan sunscreen dan diharapkan dapat menambah proteksi matahari yang diberikan oleh pemakaian sunscreen.
Radiasi ultraviolet (UV) dalam sinar matahari menghasilkan tekanan oksidatif pada kulit yang bisa menyebabkan kanker kulit dan perubahan fotoaging. Kulit melindungi dirinya sendiri dengan menggunakan antioksidan-antioksidan berberat-molekul rendah yang menetralisir tekanan oksidatif sebelum bisa menyebabkan kerusakan. Kebanyakan proteksi oleh antioksidan tergantung pada asupan makanan dan penyalurannya ke kulit. Karena antioksidan dimusnahkan atau dirubah melalui oksidasi selama netralisasi, maka proteksi sering dibatasi oleh konsentrasi kecil antioksidan yang tinggal pada kulit. Dalam upaya untuk mendukung strategi protektif ini, laboratorium kami tertarik untuk mengembangkan penggunaan antioksidan secara topikal untuk fotoproteksi. Untuk mencapai hal ini, diperlukan untuk membuat sebuah formulasi yang memungkinkan stabilitas zat-zat yang tidak stabil ini. Yang lebih penting lagi, diperlukan untuk mencari formulasi yang memungkinkan antioksidan-antioksidan ini masuk ke dalam kulit, sehingga berada pada lokasi yang tepat untuk memberikan proteksi.
Dengan menggunakan kulit babi sebagai sebuah model untuk kulit manusia, kami telah menemukan bahwa asam L-askorbat 15%, yang diprotonasi untuk menghilangkan muatan, mampu menembus kulit dan melindunginya dari radiasi UV. Setelah memaksimalkan konsentrasi larutan untuk mencapai efektifitas tertinggi, kami menunjukkan bahwa konsentrasi pada kulit, jika telah jenuh, akan menjadi stabil dengan waktu-paruh penghilangan sekitar 4 hari. Produk topikal generasi pertama ini memberikan proteksi terhadap UVB dan UVA. Karena larutan ini tidak memiliki absorpsi terhadap panjang-panjang gelombang ini (UVA dan UVB), maka disimpulkan bahwa proteksi tidak disebabkan oleh efek sunscreen. Disamping itu, larutan ini melindungi imunosupresi imbas UV. Asam L-askorbat topikal menambah konsentrasi senyawa ini yang telah ada pada kulit dan kemungkinan besar menambah efek antioksidannya.
Selanjutnya kami mengkombinasikan asam L-askorbat 15% dengan α-tokoferol 1%. Antioksidan-antioksidan ini membentuk sebuah pasangan interaktif dalam jaringan. Ketika α-tokoferol menetralisir tekanan oksidatif pada lipid, produk oksidasinya bisa dihasilkan oleh asam L-askorbat. Interaksi ini membantu memperbaharui proteksi antioksidan dalam jaringan. Setelah memaksimalkan konsentrasi dan stabilitas larutan, produk generasi-kedua ini memberikan perlindungan yang dua kali lipat bagi kulit, dibanding dengan asam L-askorbat saja.
Baru-baru ini, kami telah melakukan sebuah penelitian untuk mencari antioksidan-antioksidan yang bisa meningkatkan stabilitas larutan asam L-askorbat dan α-tokoferol. Kami menemukan bahwa penambahan asam ferulat 0,5%, sebuah antioksidan tanaman yang umum, dapat meningkatkan stabilitas dan menambah kapasitas proteksi dari UV bagi kulit. Asam ferulat, sebuah asam hidroksinamat, kemungkinan melindungi asam L-askorbat dan α-tokoferol dalam larutan dengan cara berfungsi sebagai substrat yang dikorbankan. Kami menunjukkan bahwa kombinasi antioksidan ini memberikan proteksi yang lebih baik dibanding jika tidak dikombinasikan. Efek ini jelas tidak terkait dengan efek sunscreen. Dalam artikel ini kami memaparkan perluasan pengamatan-pengamatan ini pada kulit manusia. Kami menunjukkan bahwa produk generasi-ketiga ini (kombinasi asam L-askorbat 15%, α-tokoferol 1% dan asam ferulat 0,5%) memberikan fotoproteksi UV yang efektif, menghambat pembentukan dimer thymin, dan menghambat aktivasi p53. Disamping itu, aktivasi interleukin (IL)-α, IL-6, IL-8, IL-10, dan TNF-α oleh sinar UV dapat dikurangi.
METODE
Protokol eksperimental
Penelitian dilakukan dengan persetujuan dari badan review institusi kami. Sembilan orang dewasa yang memiliki kulit tipe II atau III (kulit putih dengan kemampuan menyamak ringan sampai sedang pada saat merespon terhadap sinar UV) dimasukkan dalam eksperimen. Dua larutan diaplikasikan (2 mg/cm2) setiap hari selama 4 hari ke bagian-bagian kulit punggung yang terpisah. Semua subjek diinstruksikan untuk tidak mencuci bagian yang diolesi selama sekurang-kurangnya 2 jam. Salah satu larutan adalah larutan cair yang mengandung asam askorbat 15%, dl-α tokoferol 1%, dan asam trans ferulat 0,5% (CEFer). Larutan lain adalah wahana/plasebo. Kedua larutan (C E Ferulat dan wahananya) diperoleh dari perusahaan SkinCeuticals (Garland, Tex). Pada hari ke-3, masing-masing subjek mendapatkan radiasi tersimulasi matahari ke bagian-bagian kulit yang tidak diperlakukan, untuk menentukan dosis eritema minimal (MED). Radiasi berkisar antara 20 sampai 60 mJ/cm2 pada interval UVB 10-mJ/cm2 sebagaimana diukur dengan radiometer (IL1700, International Light, Newburyport, Miss). MED ditentukan 24 jam kemudian sebagai dosis terendah yang menghasilkan batas-batas eritema yang tepat dapat dilihat (sekitar 40 mJ/cm2). Rincian radiasi telah dipublikasikan dalam penelitian lain. Simulator matahari xenon 1000-W (Lightning Cure 200, Hamamatsu City, Jepang) dikombnasikan dengan sebuah sebuah cermin dikroik untuk menyaring sinar inframerah dan sinar tampak dan filter bandpass 292 Schott (Mainz, Jerman) untuk menghilangkan panjang gelombang yang kurang dari 294 nm dipasangkan dengan sebuah pandu cahaya cair untuk membuat titik cahaya 1 cm pada kulit yang digunakan pada output sekitar 5 mW/cm2 UVB dan sekitar 40 wM/cm2 UVA. Pada hari ke-4, bagian yang diperlakukan dengan wahana/plasebo mendapatkan 2 sampai 6x MED dan bagian yang diperlakukan dengan CEFer mendapatkan 2 sampai 10x MED, masing-masing pada interval 2x-MED. Satu hari selanjutnya, kulit diperiksa dengan kolorimetri untuk eritema, dan spesimen biopsi jarum 4-mm dari kulit yang mendapatkan MED radiasi 6x dievaluasi untuk sel-sel sunburn.
Pengukuran eritema dan sel-sel lecur-surya (sunburn)
Eritema diukur dengan kolorimetri komputer dalam sebuah fotograf kulit warna digital mode ”a”. Masing-masing titik dan kulit sekitarnya yang tidak diradiasi diukur tiga kali. Perbedaan warna antara kulit yang disinari dan yang tidak disinari menentukan eritema. Sel-sel lecur-surya ditentukan pada irisan-irisan kulit terikat formalin yang distaining dengan hematoksisilin dan eosin. Hasilnya dinyatakan sebagai nilai mean ± SD. Nilai P ditentukan dengan uji t Student two-tailed dengan menggunakan varians yang tidak seimbang.
Imunohistokimia untuk dimer thymin dan p53
Dimer thymin. Irisan-irisan jaringan yang ditanam dalam parafin dan terikat formalin dideparafinisasi dengan xylen dan direhidrasi melalui serangkaian air alkohol bermutu. Irisan-irisan mengalami pemulihan epitop imbas panas dengan menginkubasinya dalam sebuah larutan buffer sitrat (pH 6,0) (Zymed, San Fransisco, Calif) selama 20 menit pada suhu 95oC, diikuti dengan ekuilibrasi dalam larutan garam berbufer fosfat (PBS). Peroksidase non-spesifik diblokir oleh hidrogen peroksida 3%, dan pengikatan non-spesifik dihambat dengan serum kuda 1,5% pada PBS. Klon antibodi dimer antithymin monoklonal mencit KTM-53 (Kamiya Biomedical, Seattle, Wash) diencerkan dalam serum kuda 1,5%-PBS menjadi 1/1000 dan diinbukasi pada irisan-irisan selama 1 jam pada suhu 37oC. Pendeteksian dicapai dengan antibodi sekunder anti-mencit kuda dengan menggunakan avidin-biotin-link sebagaimana dijelaskan oleh penyuplai. Slide-slide dikounterstaining dengan hematoxylin.
P53. Prosedurnya identik dengan yang dijelaskan di atas, kecuali bahwa pemulihan antigen dilakukan dengan pemulihan epitop imbas panas pada buffer pH8 Tris-EDTA (Zymed). Pendeteksian dicapai dengan klon p53 anti-manusia monoklonal mencit DO-7 (Dako, Glostrup, Denmark) yang diencerkan dalam serum kuda 1,5%-PBS menjadi 1/250.
Kajian PCR (reaksi rantai polimerase) real-time
Kajian identik dilakukan pada 10 subjek tambahan dengan pengecualian subjek yang mendapatkan penyinaran pada 2x MED. Spesimen-spesimen biopsi 6-mm dari kulit yang diperlakukan CEFer dan yang diperlakukan dengan wahana/plasebo dibagi dua, setengah untuk analisis PCR dan setengah untuk imunohistokimia.
Pengisolasian RNA duta dari spesimen-spesimen biopsi kulit
Spesimen-spesimen biopsi kulit yang tidak diperlakukan, yang diperlakukan dengan UV + wahana/plasebo, dan yang diperlakukan UV + CEFer dari masing-masing subjek langsung dimasukkan dalam RNALater (Qiagen, Valencia, Calif) dan disimpan pada suhu -80oC sampai pemrosesan bisa dilakukan. Total RNA diekstrak dengan menggunakan mini kits jaringan berserat (RNeasy, Qiagen). Jaringan dihomogenisasi dalam bufer RLT dengan menggunakan sebuah homogenizer jaringan (Omni International, Bethesda, Md) dan RNA diisolasi berdasarkan protokol alat (Qiagen). Untuk menghindari DNA genomik pengkontaminasi, Dnase yang bebas-Rnase (Qiagen) digunakan. Konsentrasi RNA diukur dengan spektrofotometer dan disimpan pada suhu -82oC dalam air. Untuk sintesis DNA komplementer (cDNA), sekitar 2 µg dari RNA total ditranskripsi dengan reagen-reagen transkripsi cDNA menggunakan heksamer acak. Parameter penyiklus termal mencakup 5 menit pada 25oC selama inkubasi, 30 menit pada 42oC untuk reaksi RT, dan 5 menit pada 85oC untuk inaktivasi enzim. cDNA dimurnikan dengan alat pemurni PCR (QiaQuick, Qiagen) dan kemudian disimpan dalam bufer elusi pada suhu -82oC sampai PCR RT kuantitatif dilakukan.
PCR kuantitatif RT
Pengukuran ekspresi gen dilakukan dengan menggunakan sistem PCR RT sebagaimana dijelaskan sebelumnya. Probe TaqMan diberi label pada ujung-5' dengan molekul zat warna reporter FAM (6-karboksifluoresein; emisi λmaks = 518 nm) dan pada ujung-3' dengan molekul zat warna quencher 3' Black Hole Quencher (absorbansi λmaks = 534 nm). Reaksi PCR RT dari spesimen-spesimen cDNA dan standar cDNA dilakukan dalam total volume 25 μL dengan 2X iQ SuperMix (BioRad) dan primer-primer dan probe-probe pada konsentrasi optimum. Parameter-parameter untuk penyiklus termal adalah 3 menit pada suhu 95oC, dan 40 siklus yang melibatkan denaturasi pada 95oC selama 30 detik, pendinginan/ekstensi pada 59oC selama 30 detik. Pemantauan RT untuk emisi fluoresensi dari pembelahan probe-probe spesifik urutan dengan aktivitas nuklease dari polimersae taq memungkinkan definisi siklus ambang batas selama fase eksponensial amplifikasi.
Untuk analisis kontrol 18S RNA, IL-1α, IL-6, IL-8, IL-10, dan ekspresi RNA duta TNF-α, sebuah kurva standar dibuat dengan pengenceran cDNA berurutan yang didapatkan dari sampel tunggal sel mononuklear darah perifer manusia yang telah distimulasi selama 4 jam dengan fitohemagglutinin (5 μg/mL). Sel-sel dihilangkan, mRNA diisoasi, dan cDNA dihasilkan sebagaimana dijelaskan di atas. Perhitungan relatif ekspresi mRNA sitokin ditentukan dengan menggunakan metode kurva standar relatif. Masing-masing hasil dinormalisasi dengan menggunakan RNA ribosomal 18S sebagai sebuah kontrol internal dengan primer dan probe spesifik 18S. Semua sampel, yang dianalisis dengan PCR RT, diulangi tiga kali. Ekspresi mRNA sitokin diekspresikan sebagai unit-unit acak. Rasio antara ekspresi mRNA kulit yang diperlakukan dengan UV-CEFer dan kulit yang diperlakukan dengan UV-wahana/placebo x 100 ditentukan untuk mengevaluasi persen penekanan ekspresi mRNA sitokin untuk masing-masing sitokin yang diuji.
Desain primer dan probe sitokin
Primer-primer oligonukleotida dan probe TaqMan untuk 18S, IL-1α, IL-8, dan IL-10 didesain dengan menggunakan PrimerRQuest (Integrated DNA Technologies). Kami melakukan pencarian BLASTN untuk menguatkan total spesifitas gen dari urutan-urutan nukleotida yang dipilih untuk primer dan probe dan ketiadaan polimorfisme DNA. Untuk menghindari amplifkasi DNA genomik pengkontaminasi, salah satu dari dua primer untuk cDNA ditempatkan pada pertemuan antara dua ekson atau dalam ekson yang berbeda. Primer-primer sitokin dirancang untuk menghasilkan amplikon yang kurang dari 150 pasangan basa untuk meningkatkan efisiensi amplifikasi PCR. Set ekspresi gen untuk IL-6 dan TNF-α dibeli dari perusahaan Applied Biosystems.
Analisis statistik
Hasil dianalisis menggunakan uji Mann-Whitney dan uji Wilcoxon menggunakan software (Analyse-it, Analyse-It Software Ltd, Leeds, United Kingdom). Signifikans statistik diasumsikan untuk nilai P yang kurang dari 0,05.
HASIL
Eritema
CEFer memberikan proteksi yang signifikan terhadap eritema imbas UV jika dibandingkan dengan kulit yang diperlakukan dengan wahana/plasebo (Gbr. 1 dan 2). Pada radiasi 2 sampai 6x MED, pembacaan kolorimeter untuk wahana/plasebo berbanding CEFer menunjukkan proteksi yang signifikan (P < 0,01) oleh CEFer pada semua tingkat radiasi (Gbr. 2). Lebih daripada itu, CEFer memberikan proteksi yang signfiikan (P < 0,01) pada radiasi 8x MED dan 10x MED jika dibandingkan dengan kulit yang diperlakukan wahana/placebo yang diradiasi dengan 6X MED.
Sel-sel lecur-surya (sunburn)
Pengidentifikasian sel lecur-surya (gbr. 3) pada kulit yang diradiasi dengan 6X MED jika dibandingkan dengan kulit yang diperlakukan wahana/placebo dengan tingkat radiasi sebanding menunjukkan proteksi yang signifikan (P < 0,01) oleh CEFer, (wahana/plasebi 31,5 ± 14,3 berbanding CEFer 8,3 ± 7).
Dimer thymin dan p53
Imunohistokimia kulit yang mendapatkan radiasi 2x MED menunjukkan proteksi yang hampir sempurna oleh CEFer, ketika dibandingkan dengan wahana/plasebo, terhadap pembentukan dimer thymin dalam DNA (Gbr. 4) dan terhadap induksi p53 (Gbr. 5).
Ekspresi mRNA sitokin
Ekspresi mRNA sitokin meningkat pada kulit yang diperlakukan wahana/placebo yang diradiasi UV ketika dibandingkan dengan kulit normal yang tidak diradiasi untuk semua sitokin yang diuji. Ini signifkan untuk semua sitokin (P < 0,05, Uji Wilcoxon signed rank, 2-tailed). Kulit yang diperlakukan dengan wahana/plasebo yang disinari dengan UV menunjukkan peningkatan ekspresi mRNA, rasio rata-rata UV wahana/tidak ada UV IL-1α (7,2), IL-6 (245), IL-8 (275), IL-10 (5,6), dan TNF-α (2,5). Perlakuan dengan CEFer menghasilkan penekanan ekspresi mRNA sitokin yang signifikan secara statistik (P < 0,05) untuk semua sitokin kecuali TNF-α (P = 0,654, uji signed rank Wilcoxon, 1-tailed). Perlakuan dengan CEFer menghasilkan penekaan rasio rata-rata ekspresi mRNA sitokin dari IL-1α (2,2), IL-6 (25,8), IL-8 (42,1), IL-10 (5,6), dan TNF-α (0,8). Penekanan berksiar mulai dari 16,4% untuk TNF-α sampai 89,6% untuk IL-8 (Gbr. 6).
PEMBAHASAN
Penelitian ini menunjukkan bahwa kombinasi antioksidan fisiologis, vitamin C dan E, yang distabilkan oleh sebuah antioksidan tanaman, asam ferulat, bisa diaplikasikan secara topikal ke kulit dan menambah antioksidan alami pada kulit untuk melindunginya dari kerusakan oksidatif yang ditimbulkan sinar UV. Disamping melindungi kulit dari eritema dan apoptosis yang terkait dengan kerusakan seluler, proteksi juga diberikan terhadap mutasi-mutasi DNA imbas UV yang telah dibuktikan terkait dengan kanker kulit.
Radiasi UV menghasilkan spesies oksigen reaktif pada kulit yang bisa mengoksidasi asam-asam nukleat, protein, dan lipid, reaksi-reaksi yang tergantung pada kedekatan dengan spesies pengoksidasi. Dari waktu ke waktu perubahan-perubahan ini menghasilkan fotoaging dan kanker. Lebih dari 90% radiasi UV dalam sinar matahari adalah UVA, dan UVA lebih berperan dibanding UVB untuk menimbulkan tekanan oksidatif pada kulit. UVA menghasilkan oksigen tunggal pada kulit yang selanjutnya menghasilkan spesies oksigen reaktif termasuk radikal bebas. Sunscreen memberikan proteksi yang sangat efektif bagi kulit terhadap UVB dan lecur-surya (sunburn), tetapi proteksi terhadap UVA dan efeknya tidak sempurna. Tidak ada zat kimia sunscreen yang memberikan proteksi terhadap UVA gelombang-panjang di atas sekitar 390 nm. Proteksi sunscreen tergantung pada pengaplikasian yang cermat dan bisa terlepas oleh keringat, penggarukan dan degradasi akibat sinar matahari. Bahkan sunscreen yang terbaik sekalipun hanya mampu memblokir tidak lebih dari setengah pembentukan radikal bebas imbas UV pada kulit. Sebaliknya, antioksidan bekerja dari dalam kulit. Antioksidan tidak bisa terlepas dengan pencucian dan penggarukan kulit. Jika sudah berada dalam kulit, antioksidan menjadi stabil dan bisa memberikan proteksi selama beberapa hari.
Formulasi CEFer yang digunakan dalam penelitian ini telah dimaksimalkan untuk absorpsi perkutaneous dan fotoproteksi untuk kulit. Antioksidan-antioksidan dalam tubuh bekerja seimbang. Peningkatan salah satu antioksidan biasanya hanya menghasilkan efek sedang. Konsentrasi antioksidan yang seimbang dalam CEFer memberikan dukungan interaktif yang menghasilkan proteksi sinergis. Ada banyak antioksidan yang telah ditemukan memberikan perlindungan terhadap cahaya untuk sistem-sistem seluler dan sistem in vitro tetapi ketika diujicoba secara in vivo gagal karena tidak mampu menembus kulit. Karena antioksidan merupakan spesies yang sangat tidak stabil, maka turunan-turunannya telah disintesis untuk memberikan stabilitas. Sehingga, asam L-askorbat telah distabilkan menjadi askorbil-6-palmitat dan magnesium askorbil fosfat, dan α-tokoferol telah distabilkan menjadi tokoferol asetat atau succinat. Turunan-turunan ini banyak digunakan dalam produk-produk kulit topikal. Turunan-turunan ini memberikan stabilitas untuk antioksidan dan bermanfaat untuk pil-pl vitamin A dimana konversi menjadi antioksidan asli terjadi dalam perut. Akan tetapi, pada kulit, konversi ini tidak efisien dan sedikit sekali antioksidan yang terdapat pada kulit.
Masih belum jelas mengapa antioksidan-antioksidan dapat mempengaruhi pembentukan dimer thymin imbas UV. Sebuah penelitian terbaru terhadap karsinoma sel skuamus pada kulit dan aktinik keratosis menunjukkan mutasi dimer thymin yang banyak dalam tumor-tumor ini. Walaupun pembentukan mutasi-mutasi dimer thymin telah dianggap disebabkan oleh absorpsi UVB langsung dan tidak terkait dengan oksidasi, namun penelitian-penelitian terbaru telah menunjukkan mutasi-mutasi dimer thymin yang melimpah pada kulit yang dihasilkan oleh radiasi UVA walaupun UVA hanya sedikit diserap oleh DNA. Lebih dari pada itu, struktur kulit secara efisien mencegah penetrasi UVB dan melindungi lesi-lesi DNA imbas UVB, tetapi hanya sedikit melindungi lesi-lesi DNA imbas UVA. UVA lebih banyak menghasilkan tekanan oksidatif pada kulit dibanding dengan UVB. Antioksidan-antioksidan baru-baru ini telah ditunjukkan efektif menghambat dimer siklopyrimidin imbas UVB pada sel HaCaT manusia tetapi tidak pada DNA telanjang. Data ini menunjukkan adanya reaksi fotosensitisasi seluler yang melibatkan mekanisme transfer energi tiga-kali-lipat, yang menghasilkan pembentukan dimer pyrimidin. Disamping itu, UVA bisa menghambat enzim-enzim reparasi DNA, sehingga memungkinkan dimer-dimer thymin terus tidak tereparasi dan masuk ke dalam replikasi DNA.
P53 diinduksi oleh radiasi UV pada saat merespon terhadap kerusakan DNA dan tekanan oksidatif. P53 menyebabkan sel memperlambat replikasi DNA dan pembelahan sel selanjutnya sehingga memungkinkan sel memerlukan lebih banyak waktu untuk reparasi kerusakan DNA. Pengurangan induksi p53 oleh CEFer dalam penelitian ini bisa dikaitkan dengan proteksi kerusakan DNA dan reduksi tekanan oksidatif yang ditimbulkan oleh antioksidan.
Radiasi UV telah terbukti meningkatkan produksi sitokin dalam epidermis, dan produksi sitokin ini dianggap memegang peranan penting dalam respons inflammatory yang terkait dengan kerusakan UV dan dalam imunosupresi lokal selanjutnya. Radiasi UV telah diketahui meningkatkan sitokin-sitokin pro-inflammatory seperti IL-1, IL-6, IL-8, dan TNF-α dan meningkatkan sitokin imunosupresi IL-10. Penelitian-penelitian pada hewan telah menunjukkan bahwa produksi IL-10 lokal penting dalam pengendalian karsinogenesis imbas-UV pada mencit. Radiasi UV telah terbukti menghasilkan aktivasi reseptor faktor pertumbuhan epidermal yang tergantung ligan, resetor TNF-α, dan reseptor IL-1 disertai respons-respons yang menurun mencakup ekspresi gen-gen teregulasi NF-kB, termasuk banyak sitokin. Mekanisme aktivasi imbas UV ini belum diketahui tetapi telah diduga bahwa spesies oksigen reaktif bisa memegang peranan dalam proses ini. Kami telah menunjukkan bahwa CEFer, sebuah antioksidan topikal, mampu mengurangi ekspresi sitokin proinflammatory dan imunospresif secara signifikan yang terjadi menyertai kerusakan akibat UV. Penekanan sitokin-sitokin ini bisa memegang peranan penting dalam mengurangi inflamasi dan imunosupresi yang terkait dengan keterpaparan UV. Penelitian-penelitian lebih lanjut masih diperlukan untuk menentukan apakah aktivasi reseptor faktor pertumbuhan epidermal, reseptor TNF-α, dan reseptor IL-1 imbas UV dan pensinyalan selanjutnya dihambat oleh CEFer.
CEFer telah dibuat secara bertahap untuk memberikan fotoproteksi antioksidan yang maksimal bagi kulit. Antioksidan melindungi kulit dengan menetralisir spesies oksigen reaktif sebelum bisa merusak kulit. Walaupun penelitian ini memberikan informasi hanya tentang proteksi terhadap cedera UV akut, namun bisa diharapkan bahwa proteksi yang terus menerus bisa mencegah cedera UV kronis dari waktu ke waktu. Antioksidan topikal bekerja melalui mekanisme yang berbeda dengan sunscreen.
Comments
Post a Comment