SINYAL BAHAYA ENDOGEN, ASAM URAT KRISTALIN, SINYAL-SINYAL UNTUK IMUNITAS ANTIBODI YANG MENINGKAT

Saturday, January 16, 2010

Abstrak

Penelitian telah menunjukkan bahwa sistem imun dapat mengenali antigen-antigen sendiri (self-antigen) dalam kondisi tertentu (misalnya cedera sel) dimana jaringan tubuh mungkin menguraikan sinyal-sinyal bahaya endogen yang dapat mengaktivasi kembali sistem kekebalan. Asam urat merupakan sebuah sinyal bahaya endogen yang baru-baru diidentifikasi dilepaskan dari sel-sel yang sekarat. Temuan sebelumnya telah menunjukkan bahwa asam urat mengaktifkan efektor-efektor imun dari sistem imun alami dan adaptif, termasuk neutrofil dan imunitas sel-T cytotoxic. Akan tetapi, belum begitu jelas apakah asam urat dapat mempertinggi imunitas antibodi, yang diuji dalam penelitian ini. Jika ditambahkan pada sel-sel tumor yang sekarat atau dengan antigen protein secara keseluruhan, asam urat meningkatkan imunitas humoral yang berbasis IgG1. Lebih lanjut, asam urat menghalangi pertumbuhan tumor pada percobaan tumor lebih lanjut, yang tergantung pada sel-sel T CD4, tetapi tidak tergantung pada sel-sel T CD8. Sera yang diperoleh dari binatang-binatang yang diperlakukan dengan asam urat meningkatkan pertumbuhan tumor, sehingga menunjukkan sera memiliki peranan dalam respon antitumor. Asam urat tidak memberikan tanda untuk penambahan sel T atau perubahan populasi leukosit yang menginfiltrasi tumor. Konsisten dengan kurangnya penambahan sel T, ketika digunakan pada sel-sel dendrit, asam urat menekan faktor-faktor pertumbuhan sel T akan tetapi meningkatkan regulasi sel B yang mengaktifkan cytokin. Dengan memahami riwayat ilmiah dari signal bahaya endogen yang dilepaskan dari sel-sel yang mati, mungkin membantu dalam pemahaman yang lebih baik dari mekanisme-mekanisme pengenalan imun sendiri (Blood. 2008; 111:1472-1479)


PENDAHULUAN

Tanda dari sistem imun adalah kemampuan yang sangat baik untuk membedakan antara terinfeksi atau tidak terinfeksinya diri sendiri. Respon imun untuk jaringan-jaringan yang terinfeksi tidak selalu disebabkan oleh adanya antigen yang berasal dari mikroba tetapi lebih kepada penggambaran antigen tersebut terhadap sistem imun dalam konteks molekul yang berasal dari mikroba yang lain yang diistilahkan sebagai sebuah bentuk molekul yang bergabung dengan patogen (parhogen-associated molecular pattern/PAMP). Tidak sperti antigen, PAMP tidak khas seperti peptida dan protein, akan tetapi lebih berbentuk molekul seperti asam nukleat atau glikolipid yang merupakan subjek yang belum siap untuk berubah melalui mutasi. Ada beberapa PAMP yang termasuk lipopolysakarida (LPS), unmethylated cytosine-guanosine repeats (CpGs), dan motif-motif RNA yang teruntai menjadi dua. PAMP dikenali oleh salah satu dari beberapa reseptor mamalia, kebanyakan dari family TLR (toll-like receptor) PRR (reseptor pengenalan pola). Bukti bahwa sistem kekebalan sangat bergantung pada pamp untuk penentuan apakah harus beraktivasi atau tidak didapatk dari penelitian-penelitian dimana PAMP digunaan sebagai pembantu dalam vaksin yang mentargetkan antigen-sendiri. Sebagai contoh, vaksin-vaksin kanker yang mengandung sebuah kombinasi dari bakteri CpGs dengan HER-2/neu-derived peptida epitopes mampu mengatasi toleransi dan mampu menyediakan perlindungan jangka panjang melawan perkembangan tumor yang spontan dalam model kanker payudara mencit neu-transgenik. Disamping pemahaman PAMPs yang luas, sekarang ini telah jelas bahwa sistem imun yang adaptif dapat menjadi aktif terhadap antigen sendiri di bawah kondisi steril seperti tumor ganas, kematian sel, atau sel yang luka. Ada beberapa stimulus (yaitu signal bahaya endogen) yang telah dikategorikan dan diidentifikasi baru-baru ini yang mungkin mampu mengontrol respon-respon imun yang steril. Salah satu kelompok dari signal bahaya endogen adalah purin, yang mencakup asam urat dan adenosin triposfat (ATP).

Asam urat telah mendapat perhatian akhir-akhir ini karena sebuah seri laporan dari Rock dkk yang baru-baru ini mengidentifikasi asam urat sebagai sebuah signal bahaya yang dilepaskan dari sel-sel yang sekarat (Chen dkk; Shi dkk). Penemuan ini sekarang dikuatkan dengan penelitian-penelitian dari kelompok yang lain. Sebagai contoh, Hu dkk menemukan bahwa asam urat dilepaskan dari sel-sel tumor yang mengalami penolakan oleh imun dan asam urat memiliki peranan spesifik dalam proses penolakan tersebut. Asam urat adalah produk alami dari jalur metabolisme purin dan walaupun ditemukan pada cairan ekstraseluler (misalnya, darah dan ruang interstitial), asam urat yang dilepaskan dari sel-sel dianggap  sebagai akibat dari kristalisasi, yang menciptakan bentuk bioaktif imun dari asam urat. Asam urat kristal telah dibuktikan mengaktivasi efektor imun alami termasuk sel-sel saraf dan makrofage. Penelitian terdahulu telah menunjukkan bahwa kemampuan asam urat kristal untuk mengaktivasi efektor sistem kekebalan alami akhirnya dapat menyebabkan aktivasi imunitas sel-T cytotoxic yang spesifik antigen.

Pertanyaan yang belum terjawab adalah apakah asam urat juga dapat meningkatkan imunitas antibodi. Alasan utama untuk mengatakan adanya peranan asam urat dalam imunitas antibodi adalah bahwa respon-respon imun steril, seperti yang terlihat pada artritis rheumatoid dan tumor ganas sering terkait dengan perkembangan autoantibodi. Pada penelitian kali ini, kami menginvestigasi apakah asam urat dapat mengaugmentasi antibodi yang spesifik-antigen dalam dua sistem model yang terpisah. Pada model pertama, asam urat ditambahkan pada sel-sel sekarat yang dilukai dengan menggunakan radiasi, dengan maksud menirukan peranan fisiologi utama dari asam urat. Pada model kedua, digunakan model antigen asing ovalbumin. Pada kedua model, ditemukan bahwa asam urat kristal mendorong meningkatnya imunitas antibodi pada keadaan tidak adanya ekspansi sel T dengan tumor spesifik yang signifikan.

METODE

Hewan percobaan

Mencit C57BL/6, OT-I, Balb/c, DO11.10, dan FVB/N-TgN (MMTVneu)-202Mul (neu-tg mencit)  berasal dari Laboratorium Jackson (Bar Harbor, ME). Mencit OT-I adalah mencit transgenik untuk sebuah reseptor sel-T dengan H-2Kb yang dibatasi yang spesifik untuk epitope Oval (257-264), ovalbumin ayam; mencit DO11.10 adalah mencit transgenik untuk sebuah TCR recognizing Oval (323-339) dengan I-Ad yang terbatas. Hanya mencit betina (usia 8-12 minggu) yang digunakan, sesuai dengan panduan institusi.

Reagen

Asam urat kristal (kemurnian >99%; Sigma-Aldrich, St Louis, MO) dipersiapkan sebagaimana disebutkan sebelumnya dalam literatur. Antibodi-antibodi yang dikonyugasikan dengan Fluorochrom yang targetnya CD3, CD4, dan CD8, CD19, CD14, NKT1.1, dan CD11C berasal dari BD Pharmingen (San Diego, CA). Ovalbumin dan reagen dasar berasal dari Sigma Chemical (St Louis, MO). Peptida sintetik, Oval(323-339) dan oval(257-264), disintesis oleh Sigma Genosys (The woodlands, TX). Peptida neu mencit, p420-429 disintesis oleh Klinik Mayo (Rochester, MN). Kegunaan dari peptida neu p420-429 H-2q tetramer sebelumnya telah disebutkan. Anti-IL-4/biotinylated anti-IL-4 dan anti-IFN-γ/biotinylated anti-IFN- γ, pasangan antibodi sitokin berasal dari Endogen (Pierce, Rockford, IL) dan BD Pharmingen, secara berturut-turut. Rekombinant murine granulocyte/macrophage-colony stimulating factor (GM-CSF) didapatkan dari sistem R&D (Minneapolis, MN). IL-2 immunotoxin, denileukin diftitox (yaitu ONTAK), didapatkan dari Ligand Pharmaceuticals (San Diego, CA). Antibodi Foxp3 diperoleh dari eBiosciences (San Diego, CA).

Pertumbuhan Tumor

Sel MMC (mouse mammary carcinoma) ditentukan dari sebuah tumor spontan dari mencit neu-tg sebagaimana yang digambarkan sebelumnya. Untuk pertumbuhan tumor in vivo, mencit diinokulasi dengan 5 X 106 sel MMC melalui subkutan pada middorsum. Tumor-tumor diukur setiap beberapa hari dengan menggunakan kaliper, dan volume tumor dihitung sebagai hasil dari Panjang x Lebar x Tinggi x 0,5236. Untuk percobaan in vitro, 105 sel MMC dilapisi pada 6 lapisan yang baik dengan media sendiri atau dengan berbagai konsentrasi dari sera. Analisis poliferasi dilakukan seperti yang telah digambarkan sebelumnya. Pada beberapa kasus, tumor-tumor dihilangkan untuk pengukuran lalu-lintas intraseluler dari leukosit. Kandungan leukosit dibandingkan antara tumor-tumor dengan ukuran yang sama untuk meminimalisir variasi potensial yang disebabkan oleh ukuran tumor seperti nekrosis dan hypoxia.

Imunisasi dan tranfer adoptif

Splenosit dari mencit donor transgenik oval-TCR secara adoptif ditransfer ke dalam ujung urat vena dari mencit resipien satu hari setelah imunisasi. Mencit Balb/c menerima 2 X 106 DO11.10 splenosit per mencit; C57BL/6 menerima 10 X 106 OT-I splenosit. Mencit diimunisasi secara intraderm dengan 10 µg ovalbumin (atau peptida ovalbumin secukupnya pada kasus TCR sel-sel T transgenik) dan 5 µg GM-CSF atau 25 µg Asam urat kristal per mencit. Enam hari kemudian, mencit dibunuh dan splenosit Balb/c ditandai dengan anti-DO11.10 TCR mab KJ1-26 (Caltag, Burlingame, CA), sedangkan splenosit B6 ditandai dengan (SIINFEKL)-H2-Kb tetramer (Beckman Coulter, Fullerton, CA) dilanjutkan dengan analisis citometrik aliran. Untuk penelitian-penelitian antibodi, mencit Balb/c diimunisasi dengan protein ovalbumin secara menyeluruh sebagaimana yang digambarkan untuk mencit C57BL/6. Untuk penelitian sel tumor yang mati pada mencit neu-tg, sel-sel MMC (5 X 106/mencit) diirradiasi (150 abu-abu) dan diinjeksi dengan atau tanpa asam urat. Dua injeksi diberikan terpisah kira-kira 7 sampai 14 hari, melalui subkutan. Tujuh sampai 14 hari yang mengikuti injeksi terakhir, apakah sel-sel tumor MMC hidup yang diinjeksi atau splenosit, sel-sel nodus limpa, dan darah diambil untuk pengujian dengan cytometry aliran. Untuk menghilangkan sel-sel T regulatory sebelum imunisasi, hewan diperlakukan awal dengan denileukin diftitox seperti yang dijelaskan sebelumnya. Pada beberapa kasus, mencit dirawat awal dengan antibodi-antibodi monoklonal untuk menghilangkan baik sel-sel T CD8+ atau CD4+ sebelum melakukan dengan tumor yang mati dengan asam urat seperti yang digambarkan sebelumnya.

Uji ELIspot

Analisis ELIspot (Enzyme-Linked Immunosorbent) dilakukan secara esensial seperti yang dijelaskan sebelumnya. Splenosit yang diisolasi dari hewan yang dirawat dipaparkan tersendiri kepada media, sel-sel tumor MMC yang dibekukan dalam freezer (1 sel tumor tiap 4 splenosit), neu-peptida p420-429 (10 µg/ml), atau concanavalin A (5 µg/ml, concanavalin A, ConA) selama 48 jam.
Isolasi dan kultur In vitro dari sel-sel saraf limpa
Irisan limpa diinkubasi dengan kolagenase D (370C, selama 30 menit) dan dilewatkan melalui sebuah stainer sel 70- µm. DC dimurnikan dengan sebuah perangkat purifikasi sel CD11c untuk meningkatkan kemurnian menjadi lebih dari90% (Miltenyi, Bergisch Gladbach, Jerman). Sel-sel T transgenik TCR dimurnikan dengan perangkat isolasi sel T CD4+ atau CD8+ yang memproduksi sel-sel T yang tidak tersentuh (Miltenyi). DC yang dmurnikan dipaparkan selama dua jam dengan antigen peptida dan 10 µg/ml asam urat (dalam RPMI-1640, 2 nM L-glutamin, 25 mM HEPES, 10% FCS, 50 mM 2-mercaptothanol, dan 1% penisilin serta streptomsin) setelah media yang dipindahkan dan DC dicuci. Sel-sel T transgenik TCR kemudian ditambahkan ke dalam DCs selama 48 jam pada suhu 370C setelah sel-sel T yang dimurnikan dan ditempatkan kembali, dikembalikan kedalam media sel T untuk penambahan waktu selama 48 jam. Supernatant yang dikondisikan dengan sel T kemudian digabungkan dan diuji untuk kandungan sitokin dengan meggunakan analisis mikrosfer multiplex sebagaimana yang dijelaskan dalam “Multiplexed microsphere cytokine immunoassay.” Pada beberapa kasus, DC tidak dipaparkan ke sel T tetapi dibiarkan tetap dalam media selama 48 jam setelah media yagn dikondisikan dengan DC dihilangkan dan dinilai kandungan sitokinnya.

Uji ELISA

Untuk uji ELISA langsung, plat ELISA maxisorp (NalgeNunc international, Rochester, NY) dilapisi sepanjang malam pada suhu 40C dengan 5 µg/ml ovalbumin atau 10 µg/ml lysate tumor yang dibekukan dengan freezer dalam 0,05 M larutan carbonate-bicarbonate yang mengandung dan dibatasi dengan BSA 1%. Sera digunakan dengan pengenceran 1:120 yang dilanjutkan dengan inkubasi selama 1 jam pada suhu kamar dengan antibodi-antibodi yang dikonjugasi horseradish peroxidase terhadap IgG, IgG1, IgG2a pada mencit (Zymed, San fransisco Bagian selatan, CA). Serum dihilangkan dari wadah kontrol untuk menentukan signal dasar, yang dikurangi dari setiap nilai percobaan. Pada kasus-kasus yang lain, kurva standar disediakan untuk mengkonversi signal densitas optik menjadi sebuah konsentrasi antibodi yang dapat diestimasi secara langsung dengan konsentrasi-konsentrasi beberapa plat dari IgG, IgG1, IgG2a yang dimurnikan di atas plat ELISA. Plat dibuat dengan menggunakan tetramethylbenzadine (TMB), yang dihentikan dengan penambahan 1 N asam sulfur. Plat dibaca pada angka 450 nm pada sebuah Victor V 1420 Multilabel Reader (Perkin Elmer, Waltham, MA).

Untuk sandwich ELISA, plat dilapisi dengan 100 µg/wadah dari antibodi-antobodi poliklonal kelinci hingga mencit neu (ab36728; Abcam, Cambridge, MA). Setelah menutup dan menghentikan, 20 µg/wadah dari lysate tumor yang dibekukan dengan freezer atau buffer penguji ditambahkan pada tiap wadah dan diinkubasi pada suhu kamar selama 2 jam. Setelah dicuci, sera mencit ditambahkan pada plat dengan pengenceran 1 : 40 dalam tiga pengulangan dan diinkubasi selama 1 jam pada suhu kamar. Semua prosedur lain dilakukan sebagaimana yang dijelaskan di atas.

Immunoassay sitokin mikrosfer multipleks

Cytokin-cytokin (IL-12, IL-2, IFN- γ, IL-4, dan IL-5) diukur dengan menggunakan multiplex microsphere sesuai petunjuk perusahaan yang memproduksi alat ini (BioRad, San Diego, CA). Ringkasnya, 100 µL buffer Bio-Plex assay (BioRad) dtambahkan pada tiap wadah dari Multiscreen MABVN 1.2- µm plat mikrofiltrasi (Millipore, billerica, MA) dilanjutkan dengan penambahan 50 µL dari preparasi butiran multiplex. Setelah pencucian bead/butiran dengan 100 µL buffer pencuci, 50 µL dari sampel (yaitu supernatan/lapisan teratas dari kultur sel) atau standar-standar ditambahkan pada tiap wadah dan diinkubasi dengan kocokan selama 30 menit pada suhu kamar. Kurva standar digeneralisasi dengan sebuah campuran dari standar sitokin dan 8 seri pengenceran dengan rentang dari 0 sampai 32.000 pg/ml. Plat dicuci tiga kali kemudian dilanjutkan dengan inkubasi masing-masing  wadah dalam 25 µL antibodi-antibodi pendeteksian yang telah dicampur sebelumnya selama 30 menit dengan kocokan. Plat dicuci dan 50 µL larutan streptavidin ditambahkan pada tiap wadah dan diinkubasi selama 10 menit pada suhu kamar dengan kocokan. Butiran-butiran dicuci untuk terakhir kalinya dan disuspensi ulang dalam 125 µL buffer Bio-Plex Assay. Kadar-kadar sitokin pada sera dihitung dengan analisis 100 µL pada tiap wadah pada sebuah Bio-Plex dengan menggunakan Bio-Plex manager software (version 4; BioRad).

Cytometri Alir

Molekul-molekul permukaan sel dan hapusan Foxp3 serta cytometri alir dilakukan seperti disebutkan oleh Knutson dkk. Untuk analisis cytometri alir, angka yang sama dari setiap kejadian, biasanya 100.000, dikumpulkan dari semua kelompok.
Imunopresipitasi dan Western Blotting
Preparasi hasil lysis sel, imunopresipitasi, dan analisis Western Blot dilakukan sebagaimana yang digambarkan sebelumnya oleh Knutson dkk. Sera yang dikumpulkan dari mencit perlakuan diencerkan 50 kali pengenceran dan dicampur dengan 400 µg hasil lysis sel tumor MMC

Analisis statistik

Analisis statistik diaplikasikan dengan menggunakan GraphPad InStat untuk Windows 95/NT (graphPad Software, San Diego, CA). Kecuali bila tidak diperlukan, data dianalisis dengan menggunakan Mann-Whitney atau Student t test, dan hasilnya dianggap signifikan secara statistik jika P kurang dari 0,05.

HASIL

Signal-signal asam urat untuk meningkatkan imunitas antitumor

Sinyal bahaya yang banyak diberikan oleh asam urat diuji pada sebuah model proteksi tumor (Gambar 1). Asam urat kristalin, ketika ditambahkan dengan sel-sel tumor sekarat (diradiasi), mengakibatkan penekanan pertumbuhan tumor dengan cara yang tergantung dosis ketika diberikan sebelum terjadinya tumor, sehingga mengindiasikan adanya augmentasi dari respon imun memori. Sebagai contoh, pada hari ke-38 setelah munculnya tumor, ukuran tumor pada mencit yang sebelumnya telah diperlakukan dengan sel-sel tumor sekarat yang mengandung 100 µg asam urat adalah 143 95 mm3 (rata-rata  SEM, n=5), yang secara signifikan lebih kecil daripada tumor kontrol (hanya 25 µg asam urat) pada titik waktu yang sama (972  83 mm3; P < 0,001) dan lebih kecil daripada tumor-tumor yang berasal dari hewan yang hanya diperlakukan dengan tumor ( 695  200 mm3; P = 0,019). Dosis asam urat sebesar 100 atau 20 µg asam urat menyebabkan penekanan tumor yang sama besarnya (P > 0,05). Asam urat pada dosis yang lebih rendah (misalnya, 1 µg) tidak memiliki pengaruh pada pertumbuhan tumor, kemungkinan disebabkan karena pengenceran yang cepat. Disamping penekanan angka pertumbuhan, asam urat mampu meningkatkan kelangsungan hidup secara keseluruhan seperti yang diperlihatkan pada Gambar 1B. Hewan yang menerima 20 µg atau 100 µg asam urat mempunyai keberlangsungan hidup yang 35 hari lebih lama daripada yang diamati pada mencit kontrol dan kira-kira 14 hari lebih lama daripada hewan yang hanya diperlakukan dengan sel-sel tumor. Penipisan sel-sel T CD4, tetapi bukan sel-sel T CD8, sebelum imunisasi dapat membalikkan efek-efek penekanan tumor dari asam urat (Gambar 1C). Pada kenyataannya, penipisan sel-sel CD4 menghasilkan peningkatan aktivitas antitumor. Meskipun memiliki efek untuk menekan pertumbuhan tumor ketika digunakan sebagai metode pencegahan, namun ketika injeksi dimulai setelah tumor dibentuk, asam urat tidak dapat menekan pertumbuhan tumor jika dikombinasikan dengan sel-sel tumor sekarat (data tidak diperlihatkan). Dengan demikian, asam urat yang ditambahkan pada sel-sel tumor yang mati meningkatkan respon-respon imun antitumor yang tergantung pada sel helper T CD4.

Signal-signal asam urat untuk respon antobodi IgG1 yang meningkat
Kemampuan asam urat untuk menaikkan imunitas antibodi IgG diuji selanjutnya. Seperti yang diperlihatkan pada Gambar 2A, injeksi yang dilakukan hanya pada sel-sel tumor sekarat membangkitkan sebuah kekuatan respon antibodi IgG meskipun tidak ada asam urat eksogen. Keberadaan asam urat (25 µg) bersama dengan sel-sel tumor sekarat selanjutnya mendorong respon antibodi ini dibandingkan dengan hewan yang diinjeksi hanya dengan 25 µg asam urat. Level antibodi dengan tumor spesifik ini lebih tinggi secara signifikan dan mendekati kadar ganda antibodi yang dicapai setelah injeksi sel-sel tumor sekarat saja (P = 0,001, n = 12). Peningkatan antibodi IgG spesifik-tumor disebabkan oleh peningkatan IgG1 spesifik tumor yagn signifikan. Seperti yang diperlihatkan pada Gambar 2B, kadar-kadar IgG1 yang meningkat dengan adanya asam urat secara signifikan lebih tinggi dibandingkan dengan kadar yang dicapai dengan injeksi sel-sel tumor saja (P = 0,01). Sebaliknya, asam urat tidak menunjukkan sebuah peningkatan signifikan pada IgG2a dengan tumor spesifik (Gambar 2C; P > 0,05). Analisis cytometrik alir menguatkan temuan peningkatan IgG dengan menunjukkan bahwa mencit-mencit yang diinjeksi dengan sel-sel tumor dan asam urat memiliki kadar antibodi lebih tinggi yang mampu mengikat sel-sel tumor hidup sebagaimana dinilai dengan sitometri alir dibanding mencit yang diperlakukan sebelumnya baik dengan asam urat saja atau dengan sel-tumor sekarat saja (Gambar 2D). Pengikatan ke antigen-antigen spesifik-tumor dianalisis dengan neu-spesifik ELISA dan imunopresipitasi. Gambar 2E memperlihatkan bahwa sera yang berasal dari mencit yang terpapardengan asam urat dan sel-sel tumor memiliki kadar antibodi neu-spesifik yang meningkat dibandingkan dengan mencit yang hanya diperlakukan dengan sel tumor saja. Peningkatan ini ditentukan dengan uji imunopresipitasi (Gambar 2F). Untuk menguji apakah asam urat mampu meningkatkan respon antibodi dengan adanya sel-sel tumor sekarat, kami mengimunisasi mencit Balb/C dengan protein ovalbumin dengan atau tanpa asam urat. Sera yang diambil 28 hari setelah imunisasi menunjukkan bahwa keberadaan asam urat dengan ovalbumin menghasilkan kadar IgG spesifik-ovalbumin yang lebih tinggi secara signifikan (P < 0,05; Gambar 2G). Dan lagi, seperti dengan sel-sel tumor sekarat, analisis subtipe IgG menunjukkan bahwa asam urat memicu peningkatan IgG1 (Gambar 2H). Terjadi peningkatan IgG2a yang diinduksi oleh asam urat, tetapi peningkatan ini kecil namun signifikan (P = 0,006) (Gambar 2I). Temuan-temuan ini menunjukkan bahwa asam urat, baik ditambahkan dengan antigen sendiri atau antigen asing, meningkatkan imunitas antibodi yang berbasis IgG1.

Asam urat tidak mengaugmentasi ekspansi sel-T tidak juga merubah kadar leukosit yang menginfiltrsai tumor
Telah diduga bahwa karena asam urat menghasilkan peningkatan imunitas antibodi IgG1 spesifik tumor maka sel-sel T Th2 juga akan ditingkatkan. Akan tetapi, ELIspot IL-4 menunjukkan bahwa jumlah sel-sel pengsekresi yang spesifik tumor IL-4 dalam limpa mencit yang diperlakukan dengan tumor dan asam urat tidak meningkat dibandingkan dengan limpa mencit yang diperlakukan dengan tumor saja seperti yang diperlihatkan pada Gambar 3A (P > 0,05), walaupun tumor sendiri menginduksi respon kuat dari sel T Th2. Sel-sel tumor baik sendiri maupun dengan asam urat tidak mampu menginduksi sel-sel T yang mengsekresikan IFN- spesifik-tumor sebagaimana dinilai dengan uji ELIspot. Asam urat juga tidak menginduksi peningkatan kadar sel T yang mensekresikan IFN- spesifik-tumor (Gambar 3B) tidak juga jumlah sel-sel T CD8 spesifik neu-peptida pada saat merespon terhadap asam urat sebagaimana diuji dengan analisis tetramer (Gambar 3C).

Lagi-lagi, temuan ini diverifikasi dengan menggunakan model ovalbumin. Secara spesifik, sel-sel T spesifik ovalbumin DP11.10 TCR transgenik digunakan untuk lebih baik dalam menelusuri ekspansi sel T. Seperti ditunjukkan pada Gambar 3D, penambahan asam urat ke dalam imunisasi ovalbumin yang digunakan tidak merubah frekuensi sel T CD4+ yang spesifik ovalbumin, yang memiliki kadar yang mirip dengan yang terdapat pada hewan yang mendapatkan ovalbumin saja. Sebagai sebuah kontrol positif, GM-CSF mempromosikan ekspansi yang kuat menjadi lebih dari 2% dari semua sel T. Data yang serupa diperoleh setelah infusi sel T CD8 OT-1 yang terbatas MHC kelas I (Gambar 3E). Untuk menentukan apakah rejeksi tumor yang meningkat disebabkan oleh peningkatan efektor imun dalam lingkungan-mikro tumor, tumor-tumor baik dari mencit yang telah diperlakukan dengan sel tumor sekarat atau asam urat maupun yang dari mencit kontrol yagn tidak diperlakukan dikeluarkan, dan populasi leukosit yang menginfiltrasi tumor diuji. Sehingga untuk menghindari perbedaan terkait massa, infiltrasi leukosit dievaluasi pada tumor yang berukuran mirip. Sehingga, ketika dipanen setelah pemanenan tumor kontrol, ukuran tumor rata-rata dari mencit yang diperlakukan menghasilkan aktivasi dan meningkatnya proliferasi. Sehingga, antibodi-antibodi yang dihasilkan oleh asam urat tampaknya tidak bersifat terapeutik tidak juga sebagai inhibitor tumor.

Pengurangan Treg mengaugmentasi asam urat yang menginduksi respon antitumor

Pada penelitian kali ini, kami mengamati bahwa asam urat mengarah pada peningkatan Treg CD4+ dan CD8+ (Gambar 6A). Untuk menentukan apakah Treg terlibat dalam mencegah ekspansi sel-T, Treg dikurangi dengan denileukin diftitox (ONTAK, On) sebelum injeksi tumor, dengan dan tanpa asam urat. Seperti ditunjukkan pada Gambar 6B dan konsisten dengan penelitian terdahulu kami. Pengurangan Treg dengan denileukin diftitox mengarah pada peningkatan kadar sel T CD8+ yang diharapkan, seperti yang telah ditunjukkan sebelumnya. Tetapi, penambahan asam urat tidak lebih lanjut mengaugmentasi ekspansi sel T CD8, menujukkan bahwa walaupun asam urat sendiri gagal mengaugmentasi ekspansi sel T, namun tidak secara aktif menghambatnya. Disamping itu, sebelum pengurangan Treg tidak mengganggu kemampuan asam urat untuk menginduksi respon antitumor sebagaimana ditunjukkan pada Gambar 6C. Berbeda dengan itu, pengurangan Treg dan asam urat yang digabungkan untuk penekanan tumor, seperti yagn diharapkan.

Pembahasan

Bukti-bukti terbaru menunjukkan bahwa sistem imun mamalia telah melibatkan mekanisme-mekanisme untuk merespon terhadap sel cedera atau sel sekarat yang tidak terinfeksi melalui berbagai macam ligan baru. Alasan utama bagi evolusi mekanisme untuk merespon terhadap ligan-ligan endogen masih kontroversial, tetapi salah satu kemungkinan adalah bahwa mereka perlu mendeteksi sel-sel yang berpotensi terinfeksi yang tidak memiliki PAMP terkait atau pembantu lainnya. Atau, respon imun steril bisa terlibat dalam homeostasis jaringan normal dengan menyediakan mekanisme untuk merekrut dalam sel-sel fagosit sistem kekebalan alami seperti makrofage. Tanpa memperhitungkan alasan biologis, karakterisasi imunitas steril lebih lanjut memiliki implikasi penting untuk pengobatan autoimunitas dan potensi kondisi ganas. Meskipun telah diketahui bahwa pensinyalan asam urat mengarah pada aktivasi imuntias alami dan limfosit T, namun masih sedikit yang diketahui tentang apakah produksi antibodi terus berlangsung. Kami telah berspekulasi bahwa karena autoantibodi begitu banyak pada pebeberapa penyakit yang terkait dengan respon imun steril yang merespon terhadap sinyal-sinya; berbahaya endogen juga mengarah pada produksi autoantibodi pada kondisi-kondisi yang sama. Tentunya, penelitian kali ini menunjukkan bahwa sinyal bahaya yang baru-baru diidentifikasi, asam urat kristalin, ketika ditambahkan baik ke sel tumor sekarat atau antigen protein terlaut mampu mengaugmentasi imunitas antibodi. Secara spesifik, ditemukan bahwa asam urat meningkatkan imunitas antibodi berbasis-IgG1 terhadap antigen sendiri dan antigen asing, sehingga menunjukkan bahwa imunitas Th2 adalah respon yang didukung. Seperti yang dilaporkan sebelumnya, apabila asam urat digunakan sebagai sebuah pembantu, imunitas meningkat yang terbentuk menghasilkan peningkatan proteksi terhadpa tumor. Akan tetapi, respon antitumor tergantung pada sel-sel T CD4 tetapi tidak terhadap sel-sel T CD8.
   
Pada mencit, Ig dominan yang dihasilkan setelah munculnya respon imun terarahkan-Th2 adalah IgG1. Berbeda dengan itu, Ig utama yang dihasilkan setelah induksi imunitas Th1 adalah IgG2a. Meskipun penelitian kami menunjukkan sedikit atau tidak ada peningkatan produksi IgG2a, kami tidak bisa memastikan tidak adanya kemungkinan bahwa asam urat mempengaruhi sub-sub kumpulan antibodi lainnya (seperti IgG2b, IgG3). Pada kedua model sel tumor sekarang dan model antigen asing yang digunakan dalam penelitian kali ini, asam urat menginduksi peningkatan respon IgG1 yang signifikan, sehingga menunjukan bahwa purin juga mampu mengaugmentasi imunitas Th2 isamping kemampuannya mengaugmentasi imuintas yang diperantarai sel berbasis Th1. Pengamatan tentang produksi IL-5 yang meningkat oleh sel T CD4 spesifik ovalbumin dan produksi aktivator sel-B yang meningkat (IL-10 dan IL-6) oleh DC yang diperlakukan dengan asam urat mendukung kesimpulan ini. Ada beberapa fungsio biologis dari IgG1 pada mamalia yang berpotensi bermanfaat untuk sebuah sel cedera atau respon kematian, termasuk aktivasi komplemen, mengganggu pensinyalan sel, dan opsonisasi partikel-partikel untuk fagositosis yang meningkat. Seseorang bisa menduga bahwa respon seperti ini bisa bermanfaat untuk menetralkan virus yang tidak mengekspresikan PAMP lazim. Akan tetapi, diamati bahwa respon antibodi teraugmentasi yagn ditimbulkan oleh asam urat memiliki sedikit imbas terhadap pertumbuhan tumor secara in vivo saja. Berbeda dengan itu, antibodi-antibodi ini kelihatannya merusak dan tidak produktif. Meski demikian, kami tidak menunjukkan kemungkinan bahwa, secara in vivo, antibodi-antibodi bisa mengaktivasi mekanisme-mekanisme kerusakan tumor, seperti sitotoksisitas seluler yang tergantung antigen, yang diimbangi oleh efek yang mempromosikan tumor.
   
Diduga bahwa augmentasi imunitas IgG1 oleh asam urat bisa disertai dengan peningkatan jumlah respon sel-T Th2. Walaupun sel tumor sekarang memiliki peningkatan imunitas Th2 spesifik antigen tumor, penambahan asam urat gagal mengaugmentasi jumlah ini, sehingga menunjukkan bahwa ada faktor-faktor lain selain peningkatan jumlah sel T pensekresi Il-4 yang berkontribusi bagi respon IgG yang meningkat. Salah satu kemungkinan adalah perluasan sitokin aktivasi sel-B (seperti IL-5 dan IL-4). Berdasarkan penelitian-penelitian dengan sel Th transgenik TCR murni (yakni, D011,1 T cell), pelepasan IL-4 tidak meningkat, tetapi ada sedikit penurunan dalam produksi IL-5 yang meningkat pada saat merespon terhadap stimulasi UA. Meskipun penelitian kami tidak menunjukkan mekanisme yang mendasari peningkatan imunitas IgG1, namun sitokin seperti ini bisa mendukung aktivasi dan pematangan awl B B1. sel B B1 adalah sub-kelompok dari sel B yang secara spesifik merespon terhadap IL-5 dengan proliferasi dan produksi IgG yang meninkgat. Sel B B1 terkait utamanya dengan produksi autoantibodi-autoantibodi yang mengtragetkan antigen sendiri seperti fosfatidilcholin, immunoglobulin (seperti, faktor rheumatoid), dan DNA. Walaupun kadar antibodi pengikat tumor yang cukup tinggi diamati pada penelitian kali ini, masih belum jelas antigen apa yang ditargetkan oleh respon imun yang teraugmentasi, terkecuali fraksi kecil yang terikat ke nue mencit.
   
Temuan penting lainnya dari penelitian ini adalah bahwa, pada mencit neu-tg dan model sel-T transgenik-TCR, asam urat tidak menghasilkan ekspansi imunitas yang diperantarai sel (seperti limfosit T sitotoksik dan IFN-) karena tidak ada peningkata sel T spesifik antigen tumor pada model sel tumor sekarang tidka juga peningkatan sel T OT-1 setelah imunisasi dengan ovalbumin. Meski demikian, aktivitas antitumor yang meningkat secara lengkap dibalikkan dengan pengurangan sel T CD4, yang bisa diharapkan memberikan pereanan penting bagi sel T CD4 dalam meregulasi respon antibodi. Pada kenyataannya, pertumbuhan tumor secara substansial lebih besar pada mencit yang berkurang CD4 nya dibanding mencit yang tidak diperlakukan, sehingga menunjukkan bahwa sel-sel T CD4 memiliki peranan aktif dalam memodulasi pertumbuhan tumor tanpa adanya imunisasi sebelumnya dengan sel-sel tumor yang teradiasi. Tidak sama dengan efek yagn diamati pada hewan yang kekurangan CD4, pengurangan CD8 tidak membalkkan efek UA< tetapi justru meningkatkan efek. Karena diamati bahwa inklusi asam urat mengarah pada peningkatan Treg perifer, maka dispekulasikan bahwa sel-sel T regulatori yagn khusus ini terlibat dalam pemblokiran ekspansi imunitas yang diperantarai sel, konsisten dengan peranannya dalam mempertahankan toleransi perifer. Akan tetapi, studi pengurangan Treg dengan denileukin diftitox, yang sebelumnya efekti fdalam mengurangi Treg dan meningkatkan imunitas termediasi sel gagal menunjukkan hal ini.
   
Ketidakmampuan kami untuk mengamati ekspansi imunitas sel T CD8 bisa dijelaskan dengan fakta bahwa kami tidak menggunakan strategi imunisasi yang sama seperti yang dijelaskan pad apenelitian sebelumnya. Pada salah satu saru penelitian terdahulu yang dilakukan oleh Shi dan rekan-rekannya, ditemukan bahwa asam urat ketika diberikan bersa adengan antigen gp120 terikat manik lateks yang munir dapat mengarah pada peningkatan respon aktivitas sel-T sitotoksik dibanding dengan hewan yang diimunisasi dengan antigen saja. Kemamuan asam urat untuk meningkatkan ekspansi sel T sitotoksik dibuktikan pada penelitian lain, yang mengamati bahwa pra-perlakuan intraperitoneal mencit RIP-mOVA dengan allopurinol dan uricase mengurangi pembelahan sel in vivo dari sel T OT-1 yang terinfusi setelah pengurangan asam urat. Ada alasan-alasan potensial sehingga kami gagal mengamati ekspansi sel-T yang meningkat. Pertama, penelitian kami tidak menggunakan antigen-antigen yang terikat ke manik lateks, yang selanjutnya mengubah respon kekebalan. Atau, kami menggunakan konsentrasi asam urat yang lebih rendah pada banyak kasus. Ada kemungkinan bahwa asam urat tersebut lebih lebih berbahaya dibanding dari penelitian kami dan penelitian sebelumnya dengan kapablitas untuk mendukung respon kekebalan sel T Th1 dan Th2, dengan tergantung pada besarnya kerusakan atau cedera. Kadar asam urat yang rendah bisa mengindikasikan senesensi sel alami dimana antibodi-antibodi bisa diinduksi untuk mempermudah fagositosis oleh makrofage dengan pembalikan patologi jaringan (yakni, penyembuhan) dan penjagaan jaringan. Sejalan dengan alasan ini, Martinon dkk baru-baru ini menunjukkan bahwa kristal-kristal asam urat juga secara langsung mengaktivasi makrofage. Atau, kadar lebih tinggi seperti yang digunakan oleh Shi dan rekan-rekannya bisa mencerminkan kerusakan besar yang merupakan tanda dari sebuah infeksi.     Temuan kami tentang Treg meningkat setelah pengaplikasian asam urat juga merupakan temuan terbaru lainnya. Telah berulang kali ditemukan bahwa Treg meningkat pada pasien yang memilii berbagai tipe kanker. Meskipun dengan pengamatan ini, banyak hal yang masih belum jelas tentang sifat dari kadar Treg yagn meningkat pada pasien kanker, termasuk faktor-faktor yang mensinyalkan ekspansi Treg. Berdasarkan penelitian ini dan penelitian terdahulu yang dilakukan oleh Shi dkk., bisa diduga bahwa sinyal-sinyal berbahaya, termasuk UA, yang berasal dari sel-sel tumor sekarang mengarah pada peningkatan Treg perfier. Meskipun ada peningkatan ini, signifikansi klinis dari Treg perifer yang meningkat pada pasien melanoma, dan kanker ginjal gan lambung, sangat menunjukkan pensinyalan berhaya dari tumor. Peningkatan Treg perifer ini bis amenghasilkan migrasi Treg yang sering diamati ke dalam lingkungan-mikro tumor, yang terkait dengan patogenesis kanker pad abeberapa kanker seperti kanker ovarian.
   
Sebagai kesimpulan, pada penelitian kali ini kami mengamati bahwa sinyal asam urat berbahaya bisa menginduksi respon IgG1, disamping kemapuannya untuk mengaugmentasi CTL, sehingga menunjukkan bahwa sinyal asam urat ini juga bisa mengaugmentasi respon imun humoral. Pemahaman mekanisme alami dari pensinyalan berbahaya, selain sinyal-sinyal yang didapatkan dari mikroba eksogen (seperti CpG) bisa memiliki implikasi penting untuk vaksin, imunitas tumor, dan autoimunitas.

0 comments:

Post a Comment

BlueDEX Ads
 
Bloggerized by Blogger Template