Pengaruh Radiasi UVA terhadap proliferasi fibroblast dan sistem NO/iNOS fibroblast kulit manusia

Friday, January 8, 2010

Abstrak

Tujuan: Untuk menyelidiki efek berbagai dosis ultraviolet A (UVA) terhadap proliferasi dan sistem NO (oksida nitrat)/iNOS (oksida nitrat sintase terinduksikan) fibroblast kulit manusia dan untuk mengkaji mekanisme penuaan kulit akibat sinar matahari (photoaging).

Metode: Fibroblast-fibroblast dari kulit normal yang dikulturkan secara in vitro disinari masing-masing dengan 1, 5, dan 10 J/cm2 UVA. Aktivitas proliferasi, ekspresi protein/mRNA iNOS dan produksi NO dari fibroblast kulit manusia pada titik-titik waktu berbeda setelah radiasi dengan berbagai dosis UVA diukur masing-masing dengan uji MTT, RT-PCR, Western blotting, dan reaksi Griess.

Hasil: Tingkat ketahanan fibroblast normal seiring dengan waktu meningkat selama 72 jam. Tingkat ekspresi protein/mRNA iNOS yang rendah dan produksi NO dideteksi pada fibroblast kulit manusia normal. Tetapi pada masing-masing titik waktu setelah radiasi dengan dosis 5 dan 10 J/cm2 UVA, penurunan tingkat ketahanan sel dan peningkatan ekspresi protein/mRNA iNOS dan produksi NO menjadi lebih signifikan dibanding pada kelompok kontrol pada waktu yang sama dan pada kelompok yang disinari dengan dosis 1 J/cm2 UVA. Terdapat perbedaan signifikan  (P < 0,01 atau P < 0,05), yang mana paling signifikan pada 24 jam setelah radiasi UVA. Juga terdapat perbedaan signifikan jika dibandingkan dengan 48 jam dan 72 jam setelah dosis UVA yang sama (P < 0,01).

Kesimpulan: UVA bisa menghambat aktivitas proliferasi fibroblast kulit manusia. Ini bisa terkait dengan peningkatan ekspresi gen iNOS dan sekresi NO berlebih yang dipicu oleh UVA.

Kata kunci: Ultraviolet A (UVA); fibroblast; tingkat ketahanan; oksida nitrat sintase terinduksikan (iNOS); oksida nitrat (NO).


Ultraviolet (UV) merupakan salah satu faktor lingkungan esensial yang menginduksi inflamasi pada jaringan kulit. Ultraviolet A (UVA), meskipun tidak begitu kuat dalam hal energi biologis seperti ultraviolet B (UVB), namun membentuk 95% energi radiasi ultraviolet dalam sinar matahari dan memiliki kemampuan penetrasi yang lebih baik dibanding UVB, yang bisa menyebabkan cedera fibroblast kutaneous dalam dermis kulit. Oksida nitrat sintase terinduksikan (iNOS), sebuah enzim penting yang terlibat dalam inflamasi, terdapat pada berbagai jenis sel jaringan kulit normal dan menunjukkan aktivitas tingkat-rendah. Ketika distimulasi oleh faktor-faktor inflamasi, iNOS bisa diaktivasi dan menghasilkan banyak oksida ntrat (NO), yang merupakan salah satu radikal bebas aktif dengan sifat oksidoreduksi. NO bisa bereaksi dengan radikal bebas asal-oksigen secara in vivo dan menghasilkan faktor yang lebih aktif, ONOO-, sehingga menghasilkan sitotoksisitas dan cedera. Penelitian-penelitian sebelumnya telah melaporkan bahwa radiasi UVB menghambat proliferasi dan mempermudah apoptosis keratinosit yang dikulturkan, dan menginduksi keratinosit untuk mensintesis iNOS, yang mengkatalisis produksi dan pelepasan NO, sehingga berkontribusi bagi cedera kulit. Akan tetapi, tidak ada penelitian tentang efek UVA terhadap ekspresi iNOS dan produksi NO pada fibroblast manusia yang telah dilaporkan sejauh ini. Dalam penelitian ini, untuk membahas mekanisme patogenik dari cedera ringan kulit imbas UVA, kami menyelidiki efek-efek radiasi UVA terhadap proliferasi, mRNA iNOS dan ekspresi protein, dan produksi NO dari fibroblast kutaneous primer manusia.

BAHAN DAN METODE

1.1. Reagen

Medium DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) dan serum anak sapi dibeli dari Gibco Company, USA. Reagen trizol didapatkan dari Invitrogen Company, USA. Reagen MTT diperoleh dari Sigma-Aldrich Company, USA. Alat transkripsi-terbalik dibeli dari Ferments Company, Lithuania. Alat PCR didapatkan dari Tianwei Times Technology Company di Beijing, Cina. Alat reagen NO dibeli dari Jiancheng Biochemical Company di Nanjing, Cina. Antibodi poliklonal iNOS anti-manusia dari kelinci, antibodi monoklonal GAPDH anti-human dari kelinci, dan HRP-IgG anti-kelinci dari mencit, diperoleh dari Santa Cruz Company, USA.

1.2. Metode

1.2.1. Kultur primer fibroblast kulit manusia

Fibroblast kulit manusia dari kulup (foreskin) anak-anak setelah bedah sirkumsisi dikulturkan secara rutin dalam medium DMEM. Sel-sel dipanen dengan trypsin jika telah mencapai 80% konfluensi dan ditempatkan dalam plat 6-wadah dengan kepadatan 1 x 105 sel/wadah. Setelah diinkubasi selama 48 jam, medium kultur dikeluarkan. Keratin dan vimentin dikonfirmasi dengan teknik imunositokimia. Sel-sel berhasil dibiakkan dan disimpan dalam kaleng nitrogen. Sel-sel yang memiliki 4-10 bagian digunakan dalam eksperimen.

1.2.2. Radiasi ultraviolet

Sel-sel diradiasi dengan menggunakan perlengkapan desktop UVA (Sigma-Aldrich, USA) yang melepaskan gelombang UVA pada panjang gelombang antara 320 sampai 400 nm. Jarak keterpaparan adalah 15 cm. Dosis UVA = intensitas radiasi UVA x waktu (detik) (keterpaparan tunggal). Kami menentukan dosis UVA pada 1, 5, dan 10 J/cm2 menurut referensi.

1.2.3. Kultur sel dan perlakuan

Sel-sel fibroblast dikulturkan dalam cawan kultur 100 mm dengan kepadatan 2 x 105/mL dalam inkubator lembab yang mengandung 5% CO2 pada 37oC. Sel-sel dimasukkan kedalam 4 kelompok apabila mencapai 80% konfluensi: (1) kelompok kontrol (tidak diperlakukan dengan UVA; 24, 48, dan 72 jam), (2) kelompok dengan keterpaparan 1 J/cm2 UVA *24, 48, dan 72 jam), (3) kelompok dengan keterpaparan 5 J/cm2 UVA (24, 48, dan 72 jam), (4) kelompok dengan keterpaparan 10 J/cm2 UVA (24, 48, dan 72 jam). Sebelum keterpaparan UVA, medium kultur dikeluarkan dan sedikit PBS ditambahkan, kemudian sel ditempatkan tepat dibawah sinar UVA. Setelah keterpaparan, medium segar ditambahkan dan terus dikulturkan selama 24, 48, dan 72 jam, masing-masing. Medium kultur disentrifugasi dan larutan teratas (supernatan) dikumpulkan dan disimpan untuk pengukuran kandungan NO. Pada saat yang sama, sel-sel dikumpulkan untuk eksktraksi RNA dan protein.

1.2.4. Pengukuran viabilitas sel (uji MTT)

Sel-sel dibiakkan pada kepadatan 5 x 10-3 sel/wadah dalam plat dengan 96 wadah. Pengelompokkan sama dengan prosedur 1.2.3. Setiap sampel memiliki 6 wadah ulangan. Sel-sel dalam kelompok kontrol ditutupi dengan kertas foil timah. Larutan MTT (5 g/L, 20 µL) ditambahkan ke masing-masing wadah, dan plat diinkubasi selama 4 jam. Selanjutnya medium dikeluarkan, dan 150 µL DMSO (dimetilsulfoksida) ditambahkan kedalam masing-masing wadah. Setelah pengocokan selama 10 menit, nilai absorbansi pada panjang gelombang 570 nm (A570) ditentukan dengan Microplate EL309 Reader. Tingkat ketahanan (%) = [(A570 sampel – A570 blanko)/(A570 kontrol – A570 blanko] x 100%.

1.2.5. Ekstraksi RNA dan RT-PCR

Total RNA seluler diekstraksi dengan menggunakan reagen TRIzol. cDNA didapatkan dengan teknik RT-PCR. Urutan-urutan primer adalah sebagai berikut: iNOS forward 5'-CGGT-GCTGTATTTCCTTACGAGGCCGAAGAA-3', reverse 5'-GGTGCTGCTTGTTAGGAGGTCAAGTAAAGG-3' (259 bp). GAPDH forward 5'-TGGATATTGTTGC-CATCAATGACC-3', reverse 5'-GATGGCATGGACTGTGGTCATG-3' (460 bp). Parameter-parameter didenaturasi terlebih dahulu pada 94oC selama 5 menit, waktu siklus adalah 1 menit pada 94oC, 1 menit pada 55oC, dan 2 menit pada 72oC selama 10 menit. Produk-produk PCR (10 µL) dielektroforesis dan rasio gray-scale dihitung dengan menggunakan sistem analisis citra gel digital.

1.2.6. Western blot

Jumlah lisat (hasil lisis) sel terdenaturasi yang sebanding (40 µg) dilarutkan dengan elektroforesis gel polilakrilamida sodium dodesil sulfat (SDS-PAGE) dan ditransfer keatas membran nitroseluler (0,45 µmol/L). Setelah inkubasi dalam 0,1% Tween-PBS yang mengandung 5% susu selama 1 jam, membran diimunoblotting selama satu malam dengan antibodi-antibodi primer terhadap iNOS atau GAPDH pada pengenceran 1:1000 pada 4oC. Selanjutnya membran dicuci 5 menit dengan 0,1% Tween-PBS selama 3 kali dan diinkubasi 1,5 jam pada suhu kamar dengan antibodi sekunder terkonyugasi HRP (Peroksida Horseradish) (pengenceran 1:2000).

Setelah pencucian 5 menit dengan 0,1% Tween-PBS selama 3 kali, membran-membran dipaparkan terhadap filem dengan menggunakan sistem kemoluminesensi tertingkat. Rasio kepadatan iNOS/GAPDH dikuantifikasi dengan sistem analisis citra gel digital.

1.2.7. Pengukuran konsentrasi NO

Kandungan NO (µmol/L) dalam medium kultur masing-masing kelompok diukur menurut protokol pengujian NO yang dibeli dari perusahaan biokimia Jiancheng di Nanjing, Cina.

1.3. Analisis statistik

Semua eksperimen diulangi sekurang-kurangnya 4 kali. Data dinyatakan sebagai nilai mean ± standar deviasi (ẍ ± s) dan dianalisis dengan SPSS versi 13.0. Analisis One-Way ANOVA digunakan untuk perbandingan antar-kelompok dan analisis faktor tunggal varians digunakan untuk perbandingan kelompok. P < 0,05 dianggap berbeda menurut statistik.

2. HASIL

2.1. Efek radiasi UVA terhadap proliferasi fibroblast kulit manusia

Kami menemukan bahwa tingkat ketahanan sel yang diperlakukan dengan UVA 1 J/cm2 pada titik-titik waktu berbeda (24, 48, dan 72 jam) tidak menunjukkan perbedaan signifikan dibanding dengan sel-sel kontrol pada titik-titik waktu yang sama. Sedangkan tingkat ketahanan sel yang diperlakukan dengan UVA 5 atau 10 J/cm2 lebih rendah dibanding sel kontrol (P < 0,01). Tingkat ketahanan menurun dengan cara yang tergantung pada dosis UVA (P < 0,01). Tingkat ketahanan sel 24 jam setelah keterpaparan terhadap UVA 5 dan 10 J/cm2 jauh lebih rendah dibanding pada 48 dan 72 jam (P < 0,05, Tabel 1).

2.2. Efek radiasi UVA terhadap ekspresi mRNA iNOS pada fibroblast kulit manusia

Pada titik waktu yang sama setelah berbagai dosis radiasi UVA, ekspresi mRNA iNOS meningkat dengan dosis UVA yang juga meningkat (P 0,05). Meskipun dengan dosis radiasi UVA yang sama, ekspresi mRNA iNOS pada 24 jam lebih tinggi dibanding pada titik-titik waktu yang lain (P < 0,01, Gbr. 1, Tabel 2).

2.3. Efek radiasi UVA terhadap ekspresi protein iNOS pada fibroblast kulit manusia

Protein iNOS tidak banyak diekspresikan di kelompok kontrol pada masing-masing titik waktu. Pada titik-titik waktu yang sama, ekspresi protein iNOS meningkat seiring dengan peningkatan dosis UVA (P < 0,01). Meskipun dengan dosis keterpaparan UVA yang sama, ekspresi protein iNOS pada 24 jam lebih tinggi dibanding pada titik-titik waktu yang lain (P < 0,01, Gbr. 2. Tabel 3).

2.4. Efek radiasi UVA terhadap produksi NO pada fibroblast kulit manusia

Kandungan NO dalam supernatan (lapisn teratas) pada masing-masing titik waktu (24, 48, dan 72 jam) meningkat dibanding dengan kelompok kontrol (P < 0,01). Pada titik waktu yang sama, produksi NO meningkat seiring dengan peningkatan dosis UVA (P < 0,01). Meskipun pada dosis keterpaparan UVA yang sama, produksi NO pada 24 jam lebih tinggi dibanding pada titik-titik waktu yang lain (P < 0,01, Tabel 4).

3. PEMBAHASAN

Fibroblast merupakan komponen sel utama untuk pemulihan cedera pada jaringan kulit. Pada kondisi normal, fibroblast berada dalam keadaan istirahat. Apabila terjadi cedera kulit atau lesi patologik, fibrobast menunjukkan abnormalitas proliferasi dan metabolisme, serta perubahan ekspresi gen. Dengan demikian, pembiakan (kultur) fibroblast kutaneous primer akan menjadi sarana penting untuk meneliti photoaging kulit dan penyakit-penyakit lain yang terkait dengan disfungsi fibroblast.

Penuaan kulit merupakan sebuah proses patofisiologi kompleks yang mempengaruhi banyak lapisan struktur kulit, diantaranya yang paling mengalami perubahan mencolok adalah lapisan dermis. Dan fibroblast merupakan komponen sel yang paling penting dalam dermis, yang membentuk basis struktural utama dari fungsi dermis. Penelitian-penelitian telah memvalidasi bahwa radiasi UVA bisa menyebabkan cedera terhadap DNA nuklear dan mitokondrial, menginduksi apoptosis berbagai tipe sel dan mempengaruhi ekspresi gen seperti ICAM-1 dan MMP, serta sitokin-sitokin seperti IL-6 dan IL-10. Leccia, dkk. mengamati peningkatan apoptosis pada fibroblast kutaneous manusia dengan perlakuan radiasi UVA dengan meneliti nukleosom sitoplasmik dengan metode ELISA, yang merupakan laporan pertama untuk memverifikasi efek UVA dalam menimbulkan apoptosis pada fibroblast kutaneous manusia normal. Penelitian-penelitian yang dilakukan para peneliti domestik beberapa tahun belakangan telah menemukan bahwa UVA juga bisa menyebabkan kerusakan pada sintesis kolagen dalam fibroblast dermis kultur primer, menyebabkan krenasi sel, menurunkan proliferasi, menimbulkan apoptosis, dan menginduksi ekspresi mRNA 5-lipoksigenase yang berlebihan dalam sel-sel ini. Akan tetapi, A terhadap ekspresi iNOS dan produksi NO pada fibrobast kutaneous masih jarang. Lebih daripada itu, bahkan dalam beberapa penelitian tentang masalah ini, dosis radiasi UVA yang digunakan overload, dan pengamatan tidak sistematis. Hasil kami menunjukkan bahwa radiasi UVA bisa menurunkan proliferasi fibroblast, menginduksi ekspresi iNOS yang berlebihan, dan meningkatkan produksi NO pada fibroblast. Efek-efek ini menunjukkan korelasi dengan dosis radiasi UVA dan periode waktu kultur pasca-radiasi. Data-data ini menandakan bahwa radiasi UVA tidak hanya merusak kapabilitas proliferasi fibroblast tetapi juga mengaktivasi jalur iNOS/NO dalam fibroblast. Jalur iNOS/NO terdapat pada semua jenis sel dalam kulit termasuk ekratinosit, melanosit, sel Langerhans, fibroblast, dan sel-sel endotelium, dan berpartisipasi dalam inflamasi dan respons imun kulit. Kegagalan sistem sinyal NO berdampak pada inflamasi, hipertropi, penyakit kulit autoimun, dan kanker kulit. Sebagai sebuah radikal bebas berfungsi-gand dengan efek penginduksi apoptosis dan anti-apoptosis, NO menunjukkan efek dengan tergantung pada konsentrasi NO, tipe sel target, dan lingkungan patofisiologis sel. Yakni, pada konsentrasi rendah, NO memiliki efek anti-apoptosis, sedangkan pada konsentrasi tinggi, NO menginduksi apoptosis sel dengan mempermudah pembentukan ONOO-. Dalam penelitian ini, penurunan proliferasi dan peningkatan sistem iNOS/NO pada fibroblast kulit manusia paling signifikan pada 24 jam setelah radiasi UVA, yang sejalan dengan karakteristik dinamis dari kenampakan puncak luka-bakar matahari pada 24 jam dan terus berlanjut 2-3 hari. Ini menandakan bahwa inhibisi proliferasi fibroblast oleh UVA bisa terkait dengan stimulasi jalur iNOS/NO oleh UVA yang menyebabkan produksi NO berlebihan dan mengarah pada apoptosis. Choe, dkk. mengamati bahwa donor NO bisa eningkatkan tingkat ekspresi MMP-1, dan MMP-2 sebesar 153% dan 243%, masing-masing pada fibroblast kutaneous, dan inhibitor NOS bisa mengurangi sintesis MMP-1 dan MMP-2 pada fibroblast kutaneous manusia yang disinari UV. Ini menunjukkan bahwa NO bisa mendegradasi matriks relevan melalui promosi ekspresi MMP-1 dan MMP-2 yang mengarah pada perubahan jaringan konektif yang diamati pada photoaging. Greenacre dkk. mengidentifikasi ekspresi iNOS yang berlebihan dan produksi NO yang berlebihan pada kulit inflamasi mencit, yang mengarah pada pembentukan peroksida nitrat, produk reaksi dari superoksida dan NO, dan mempromosikan kebocoran plasma dan edema inflamasi kulit. Dengan demikian, kami menyimpulkan bahwa cedera ringan akut dan kronis pada kulit imbas UVA paling tidak dapat menjadi konsekuensi dari ekspresi iNOS yang berlebihan dan produksi NO yang berlebihan dalam fibroblast kutaneous, yang menghambat proliferasi dan menginduksi apoptosis fibroblast, dan meningkatkan ekspresi MMP-1 dan MMP-2, yang mengarah pada degradasi matriks dermis sehingga mempercepat penuaan kulit. Hasil-hasil kami juga menunjukkan bahwa intervensi iNOS atau interferensi sintesis NO bisa menunda photoaging kulit, sehingga memberikan bukti eksperimental untuk menyelidiki mekanisme-mekanisme photoaging kulit dan untuk mengembangkan produk-produk perawatan kulit anti-penuaan terbaru.

0 comments:

Post a Comment

BlueDEX Ads
 
Bloggerized by Blogger Template