Pengaplikasian Metode Kromatografi Gas–Spektrometri Massa Tandem (GC-MS-MS) untuk Analisis Pestisida Dalam Buah dan Sayuran

Sunday, January 3, 2010

Abstrak

Sebuah metode analitik baru diusulkan yang menggunakan kromatografi gas bersama dengan spektrometri massa tandem (GC-MS-MS) untuk analisis 31 residu pestisida dan sekitar 8000 sampel buah dan syuran segar (kacang hijau, ketimun, lada, tomat, terung, semangka, melon, dan marrow). Pesitisida diekstraksi dengan diklorometana. Cara ionisasi optimal, baik ionisasi tubrukan elektron atau ionisasi kimiawi, dipilih untuk masing-masing pestisida dalam prosedur yang sama. Carbofrit digunakan dalam liner dan dikombinasikan dengan selektifitas detektor untuk menghindari pembershan tambahan. Sehingga, bukan hanya uang dan waktu yang bisa dihemat, tetapi ketidakpastian metode berkurang dalam pengaplikasiannya terhadap analisis rutin. Recovery rata-rata pada ketimun yang didapatkan untuk masing-masing pestisida berkisar antara 71 sampai 119% pada dua tingkat fortifikasi berbeda (n = 10 masing-masing) yang berkisar antara 7 sampai 300 ng/g (tergantung pada pestisida). Standar deviasi relatif lebih rendah dari 19% untuk semua senyawa yang diuji. Batas deteksi dan penghitungan lazimnya <1 ng/g yang jauh lebih rendah dibanding kadar residu maksimum yang ditentukan oleh hukum di Eropa.

Kata kunci: Buah, Sayuran, Analisis makanan, Pestisida


1. Pendahuluan

Pestisida penting dalam praktik pertanian moderen, namun karena aktivitas biosida dan risiko potensial yang dimiliki terhadap konsumen, pengendalian keberadaan residu pestisida dalam makanan semakin mendapatkan perhatian masyarakat umum. Pemerintah dan organisasi-organisasi internasional sedang berupaya untuk meregulasi penggunaan pestisida dengan menetapkan kadar residu maksimum (MRL) dalam makanan. Program-program pemantauan pestisida dibentuk oleh pemerintah untuk menilai dan mengontrol kualitas sayuran, sehingga turut mengevaluasi dan memperkuat penggunaan pestisida yang baik dalam praktik pertanian.

Untuk mendeteksi berbagai pestisida yang diaplikasikan ke tanaman pangan biasanya perlu digunakan teknik-teknik pemisahan analitis seperti kromatografi gas (GC) atau kromatografi cair berkinerja tinggi (HPLC). Kedua teknik ini telah banyak digunakan bersama dengan metode-metode pendeteksian selektif golongan, khususnya untuk GC dengan ECD (pendeteksian tangkapan elektron), FPD (fotometri nyala), dan NPD (nitrogen-fosfor). Tak satupun dari detektor-detektor ini yang memberikan hasil yang tegas dan semua mengalami interferensi (gangguan sinyal). Karena alasan inilah spektrometri massa (MS) telah menjadi populer di lab-lab residu pestisida. Metode MS bisa menghitung dan menegaskan hasil melalui scan lengkap atau spektra pemantauan ion terpilih (SIM). Sayangnya, scan lengkap sering tidak memberikan sensitifitas yang cukup pada sampel sebenarnya tetapi SIM, yang meningkatkan sensitifitas, mengurangi informasi kualitatif secara signifikan, sehingga meningkatkan risiko hasil false positive (diidentifikasi ada residu pestisida padahal sebenarnya tidak ada).  Kombinasi GC dengan spektrometri massa tandem (MS-MS) telah terbukti dapat dialikasikan dalam analisis kontaminan-kontaminan seperti pestisida atau metabolisme dalam sampel-sampel kompleks seperti cairan-cairan biologis, air atau buah dan sayuran.

Selektifitas yang meningkat dari teknik ini mengurangi pengaruh matriks, dan merendahkan batas deteksi. Tingkat kepercayaan hasil juga membaik karena kualitas informasi yang didapatkan tidak berkurang seperti pada SIM. Detektor jebakan ion benchtop menjadikan teknologi MS-MS ini memiliki harga yang terjangkau dan pelatihan personil yang terbatas.

Strategi-strategi ekstraksi dalam analisis residu pestisida multi-golongan cukup bervariasi tetapi penggunaan ekstraksi-ekstraksi pelarut organik lebih dipilih dalam analisis laboratorium rutin karena sederhana, cepat, dan recovery yang tinggi untuk senyawa-senyawa dalam rentang polaritas yang luas. Tahap-tahap pembersihan biasanya menyertai proses ini, yang mengurangi jumlah interferensi dan pengaruh-pengaruh negatifnya terhadap selektifitas sinyal analitik dan penjagaan instrumen. Akan tetapi, proses pembersihan ini cukup mahal dan memakan banyak waktu serta meningkatkan ketidakakuratan metode ini.

Paper ini mengusulkan sebuah metode baru untuk menentukan 31 pestisida multi-jenis dalam sayuran segar yang cocok untuk digunakan dalam analisis rutin. Metode ini didasarkan pada ekstraksi sayuran yang sederhana dengan diklorometana tanpa pembersihan dan analisis GC-MS-MS. Metode ini divalidasi dan diterapkan dengan menggunakan kriteria kendali mutu yang ditentukan dalam laboratorium residu pestisida CUAM, terhadap analisis 8000 sampel biah dan sayuran yang ditanam dalam rumah kaca El Ejido (Almeri, Spanyol).

2. Metodologi

2.1. Bahan-bahan kimia

Diklorometana, sikloheksana, heksana, aseton, dan metanol (untuk analisis residu-residu pestisida) dari Scharlau (Barcelona, Spanyol) digunakan langsung saat diterima. Standar-standar analitik pestisida dan kafein, yang digunakan sebagai standar internal (I.S.), dibeli dengan kemurnian yang bersertifikasi dari Dr. Ehrenstorfer (Ausburg, Jerman). Larutan baku dari masing-masing pestisida dipersiapkan dalam aseton pada konsentrasi yang berkisar antara 75 sampai 550 mg/L dan disimpan dalam sebuah freezer pada suhu -30oC (1 tahun waktu penyimpanan maksimum). Larutan-larutan didapatkan dengan pengenceran yang sesuai dengan sikloheksana dan disimpan dalam refrigerator (4oC) (2 bulan waktu penyimpanan maksimum). Tidak ada degradasi yang diamati untuk senyawa-senyawa selama waktu penyimpanan yang disebutkan diatas. Sodium sulfat anhidrat untuk analisis residu didapatkan dari Pareac (Barcelona, Spanyol).

2.2. Peralatan

Seperangkat alat GC-MS-MS Saturn 2000 (Varian, Walnut, Creek, CA, USA) digunakan untuk semua analisis. Seperangkat autosampler Varian 8200 digunakan untuk melakukan injeksi 10-μ dengan menggunakan suntikan ukuran 100-μL. Kromatografi gas (model CP-3800) digandengkan dengan injektor suhu terprogram split/splitless 1079 yang beroperasi dalam mode injeksi volume besar dan sebuah sistem pengontrol aliran elektronik (EFC). Liner gelas mengandung sumbatan Carbofrit (Restek, Bellefonte, PA, USA). Sebuah kolom kapiler silika 2mx0,2mm I.D dari Supelco (Bellefonte, PA, USA) yang digandengkan dengan sebuah kolom analitik DB-5MS 30 mx0,25 I.D., dengan ketebalan 0,25 μm dari J&W Scientific, digunakan. Elektroda jebakan ion adalah SilChrom yang dilapisi untuk mereduksi interaksi kimia dengan permukaan-permukaan. Spektrometer massa dioperasikan dalam mode ionisasi tubrukan elektron (EI) dan mode ionisasi kimiawi (CI) dan opsi MS-MS digunakan. Pustaka MS-MS dibuat utuk analit-analit target pada pusta MS komersial dan kondisi-kondisi eksperimental kami tersedia untuk informasi tambahan. Helium (kemurnian 99,999%) digunakan sebagai gas pengangkut.

2.3. Pengambilan dan penyimpanan sampel

Sayuran segar diambil dan diangkut sesuai dengan panduan 79/700/CEE. Sampel-sampel dianalisis dalam 24 jam dan disimpan pada 4oC sampai saat ekstraksi.

2.4. Prosedur analitik

2.4.1. Prosedur ekstraksi

Sampel-sampel syuran dengan berat 2-kg diiris-iris dengan pengiris yang sesuai (Hamilton Beach, Washington, USA). Alikuot 50,0 g ditimbang kedalam sebuah wadah galas dan dihomogenisasi dengan 105 mL diklorometana pada alat Polytron PT1200 (Kinematica, Littan/Luzern, Switzerland) selama 2 menit. Sodium sulfat anhidrat (80 g) kemudian ditambahkan. Campuran dibiarkan diam selama 2 menit, kemudian disaring melalui corong Buchner 12-cm dan disaring kembali dengan kertas saring bersama sodium sulfat anhidrat ke dalam sebuah labu kimia bulat. Penguapan pelarut sampai kering dilakukan dalam evaporator rotasi (35-40oC). Residu-residu kering dilarutkan kembali dengan 5 mL sikloheksana dan 1 mL larutan ini ditambahkan ke labu kimia volumetri 2-mL bersama dengan 50 μL larutan I.S. Volume akhir 2-mL dicapai dengan sikloheksana dan 10 μL ekstrak akhir ini diinjeksi dalam analyzer dengan menggunakan teknik injeksi sandwich.

2.4.2. Kondisi-kondisi intrumental

Suhu injektor diprogram mulai dari suhu 70oC (dipertahankan 5 menit) sampai 300oC pada 100oC/menit (ditahan 10 menit). Lubang split pada awalnya terbuka kemudian ditutup pada 0,5 menit untuk mentransfer analit-analit ke kolom selama 3 menit lainnya. Tekanan gas pengangkut ditentukan pada 8 psi (dipertahankan 26 menit). Kemudian dikurangi dari 8 menjadi 6 psi dengan gradien 2 psi/menit (dipertahankan 15,1 menit) (1 psi = 6894,76 Pa). Suhu oven dinaikkan dari 70oC (dipertahankan 3,5 menit) saampai 150oC pada 50oC/menit, kemudian menjadi 180oC pada 5oC/menit (dipertahankan 5 menit), kemudian 205oC pada 4oC/menit (dipertahankan selama 5 menit dan terkahir pada 300oC pada 4oC/menit (dipertahankan 5 menit). Waktu total untuk analisis GC adalah 56,1 menit.

Spektrometer massa dikalibrasi setiap pekannya setelah uji software. Udara dan air diperiksa setiap hari serta tekanan reagen CI (metanol). Semua senyawa dianalisis dengan menggunakan tipe bentuk gelombang non-resonan. Dengan tergantung pada analit, ada dua mode ionisasi yang digunakan (CI dan EI). Parameter-parameter umum untuk kedua mode ini adalah tegangan multiplier sebesar 1700 V, offset multiplier +200, dan jebakan, manifold dan suhu jebakan, percabangan pipa, dan saluran transfer masing-masing adalah 200, 50 dan 280oC. Untuk mode CI arus emisi ditentukan pada 30 μA, waktu ionisasi pra-scan adalah 100 μs dan nilai target AGC adalah 2000 hitungan. Pada mode EI nilai-nilai ini masing-masing adalah 80μA, 1500 μs, dan 5000 hitungan. Kondisi-kondisi MS-MS yang spesifik untuk masing-masing analit ditunjukkan pada Tabel 1.

3. Hasil dan Pembahasan

3.1. Efek variabel-variabel eksperimental

3.1.1. Variabel-variabel instrumen

Kondisi-kondisi GC dioptimalkan untuk memisahkan pesitisida-pestisida yag diteliti. Karena itu, suhu-suhu berbeda dan program aliran gas berbeda diuji untuk menetapkan analit-analit campuran standar dalam waktu yang singkat. Perlu disebutkan bahwa detektor bisa menentukan hingga sampai empat pestisida yang keluar bersama dalam mode MS-MS. Volume 10 μL diinjeksikan dengan teknik volume-besar tipikal untuk menurunkan batas deteksi.

Untuk MS, sensitifitas dimaksimalkan dengan cara mengoptimalkan jumlah ion-ion target kedalam jebakan dengan AGC. Nilai target AGC yang lebih tinggi dari yang kami gunakan bisa menyebabkan interaksi elektrostatik antara ion-ion yang memberikan sinyal-sinyal lebih buruk sehingga menghasilkan sensitifitas yang lebih rendah. Ion induk dipilih untuk masing-masing anait dengan mempertimbangkan m/z nya dan kelimpahan relatif untuk meningkatkan sensitifitas dan selektifitas. Optimisasi parameter-parameter disosiasi imbas-tubrukan (CID) dilakukan untuk menghasilkan spektra MS-mS dengan kelimpahan relatif ion induk antara 10 dan 30%. Puncak dasar yang diperoleh dipilih untuk penghitungan pada kebanyakan kasus, kecuali untuk beberapa analit yang memiliki berbagai puncak intens (metalaksil) atau ion utama merupakan kelompok (bromopropilat). Pada kasus-kasus ini, jumlah ion utama digunakan untuk perhitungan. Gambar 1 menunjukkan spektra MS-MS dari contoh-contoh yang disebutkan.

3.1.2. Variabel-variabel ekstraksi

Ekstraksi dengan pelarut organik dipilih untuk mengekstraksi pestisida-pestisida dari sayuran segar karena prosedurnya yang sederhana dan cocok untuk digunakan sebagai analisis rutin. Diklorometana dipilih karena kapasitasnya dalam mengekstraksi pestisida dengan sifat kimia danfisik yang berbeda. Meskipun demikian, selektifitas diklorometana yang rendah mengarah pada terekstraksinya beberapa interferensi matriks yang biasanya mengharuskan tahapan-tahapan pembersihan tambahan. Interferensi seperti ini biasanya mengurangi selektivitas metode pendeteksian dan memperkotor instrumen sehingga meningkatkan waktu perawatan instrumen. Akan tetapi, kami telah menggunakan alternatif yang lebih sederhana dna kurangmahal untuk tahapan-tahapan pembersihan dengan menggunakan kombinasi paket liner gelas Carbofrit dengan pendeteksian MS-MS seperti yang telah dilakukan oleh beberapa peneliti lainnya. Carbofrit mengurangi jumlah zat volatil-rendah dan zat nterferensi dalam instrumen dan MS-MS meningkatkan selektivitas sinyal analitik. Kombinasi ini sangat mudah dalam pengaplikasian metode padaanalisi rutin terhadap jumlah sampel yang besar. Bisa diamati bahwa perubahan liner gelas, carbofritdan kolom pelindung direkomendasikan setelah setiap 180-200 sampel. Akan tetapi, ketiadaan Carbofrit menghasilkan penambahan frekuensi maintenans instrumen, khususnya  untuk kolom analitik (kolom tersumbat yang memerlukan pemotongan beberapa sentimeter pada ujungnya).

3.2. Validasi metode

3.2.1. Pengidentifikasian analit-analit target

Jendela waktu retensi (RTW) didefinisikan sebagai waktu retensi rata-rata ±10 standar deviasi waktu retensi dari 10 sampel blanko yang ditambahkan pada standar kalibras tingkat-menengah untuk masing-masing senyawa. Analit-analit target dicari dalam RTW yang sesuai. Atau, keterulangan waktu retensi antar-hari ditunjukkan pada Tabel 4.

3.2.2. Kuantifikasi analit-analit target

Ekstrak-ekstrak sampel blanko yang dibubuhi dengan pestisida pada tiga tngkat konsentrasi berbeda diinjeksikan untuk melakukan kalibrasi instrumen. Linearitas kurva kalibrasi diteliti untuk masing-masing pestisida dengan mempertimbangkan area puncak yang relatif terhadap I.S. Hasil kuantifikasi yang lebih baik didapatkan apabila titik asal (0,0) dimasukkan dalam regresi linear. Linearitas yang baik dari respons ditemukan untuk semua pestisida pada konsentrasi dalam interval yang diuji, dengan koefisienregresi linear yang lebih tinggi dri 0,967. Tabel 2 menunjukkan hasilnya. Sebuah kajian recoveri untuk setiap pestisida pada dua tingkat fortifikasi berbeda dilakukan untuk menilai efisiensi ekstraksi metode yang diusulkan. Untuk itu, 10 sampel ketimun yang tidak terkontaminasi dibubuhi dengan pestisida dan diolah seperti disebutkan diatas. Data recovery rata-rata dan standar deviasi relatif (RSD) didapatkan seperti ditunjukkan pada Tabel 3. Recovery senyawa antara 70 sampai 120% telah ditentukan sebagai kriteria untuk validasi metode. Semua pestisida yang ada memberikan recovery yang berterima dalam interval validasi yang ditentukan dan RSD lebih rendah dari 18% pada semua kasus. Sinyal-sinyal dari kromatogram 10 sampel ketimun yang diekstraksi dan diinjeksi dievaluasi sebagaimana direkomendasikan oleh IUPAC untuk memperkirakan batas-batas pendeteksian (LOD) dan kuantifikasi (LOQ). Hasil yang diperoleh juga ditunjukkan pada Tabel 3. Data antar-hari untuk recovery dan keterulangan (n = 10) ditunjukkan pada Tabel 4. Data didapatkan untuk ukuran-ukuran pada hari-hari berbeda dan dengan menggunakan kurva kalibrasi berbeda. Data recovery berada dalam interval validasi dan RSD lebih rendah dari 19% pada semua kasus.

3.2.3. Prosedur konfirmasi

Konfirmasi sebuah senyawa yang sebelumnya diidentifikasi dengan waktu retensi saja dilakukan dengan membandingkan spektra MS-MS yang didapatkan dalam sampel dengan yang sebelumnya disimpan sebagai spektra referensi. Spektra referensi diperoleh setiap hari dan disimpan dengan menginjeksikan sebuah sampel ketimun blanko yang dibubuhi pada konsentrasi tingkat kalibrasi kedua. Hasil perbandingan (kecocokan) diberi skala sampai 1000 utuk kecocokan yang paling baik (spektra identik). Untuk menentukan ambang batas kecocokan untuk masing-masing pestisida, kecocokan rata-rata spektra MS-MS dari 10 injeksi standar tingkat-menengah ditentukan dan 250 dikurangi dari rata-rata. Software instrumen selanjutnya secara otomatis akan menguatkan keberadaan pestisida jika kecocokan melebihi nilai ambang-batas dan rasio sinyal/rasio lebih besar dari 3. Tabel 3 memuat nilai kecocokan ambang-batas yang didapatkan untuk masing-masing senyawa.

3.2.4. Kriteria kualitas

Untuk menjami hasil berkualitas dalam analisis rutin, beberapa kriteria telah ditentukan. Untuk ini, ekstrak sampel blanko yang dibubuhi pada konsentrasi tingkat kalibrasi ke-dua, dan sebuah kurva kalibrasi diolah setiap hari dengan sekumpulan sampel. Ekstrak blanko meminimalisir peluang diperolehnya hasil false positive karena kemungkinan kontaminasi pada proses ekstraksi atau karena bahan kimia. Efisiensi prosedur ekstraksi diperiksa dengan bubuhan matriks yang juga membantu mendeteksi kelainan-kelainan akibat ekstraksi atau penyebab instrumental. Analisis sampel dalam urutan dilakukan jika recovery berkisar antara 60 sampai 130% dalam bubuhan matriks. Kurva kalibrasi digunakan untuk memeriksa linearitas dalam rentang konsentrasi kerja dan untuk menghindari kesalahan kuantifikasi akibat efek matriks atau variasi instrumental. Tabel 5 merangkum informasi tentang parameter dan kriteria yagn digunakan.

3.3. Pengalikasian metode

Dalam periode September 2000 – Juli 2001, sekitar 8000 sampel matriks buah dan sayuran segar (kacang hijau, ketimun, lada, tomat, terung, semangka, melon, dan marrow) dianalisis dengan metode analitik pada CUAM yang terletak di El Ejido (Almeria, Spanyol). Dengan menggunakan pencarian otomatis dan menu identifikasi sistem data instrumen yang diprogram dengan analisis rutin, kriteria kualitas yang dipilih bisa melakukan identifikasi, kuantifikasi dan konfirmasi pestisida. Selama 2000 dan 2001, metode ini telah terbukti sangat bermanfaat dalam pengendalian residu-residu pestisida pada beberapa buah dan sayuran segar bahkan pada konsentrasi yang lebih rendah dari MRL (kadar residu maksimum) yang ditentukan oleh Uni Eropa (EU) dan di negara lainnya. Gbr. 2 menunjukkan sebuah contoh penentuan positif dalam sebuah sampel ril dan Tabel 6 merangkum hasil-hasil yang ditemukan di atas batas yang dibolehkan oleh undang-undang di Spanyol da EU. Perlu disebutkan bahwa persentasi positif rendah yang terjadi, yang bisa dikaitkan dengan area yang diteliti, telah menyadari peggunaan pestisida yang baik. Ini sebagian disebabkan oleh pendeteksian dan pengendaian penggunaan pestisida oleh laboratorium-laboratorium independen seperti CUAM. Pestisida yang paling sering ditemukan dalam matriks lada adalah metataksil (37 kasus), diikuti dengan cypermethrin dan methamidophos (10 kasus masing-masing) dan endosulfan (empat kasus). Pada matriks ketimun analit yang ditemukan pada kebanyakan kasus pada konsentrasi yang melebih batas MRL yang ditentukan Uni Eropa (EU) adalah  metalaksil (37 kasus). Acrinathrin melebihi MRL Spanyol dalam lada pada tujuh smpel dan sembilan sampel untuk ketimun. Tebukonazol (lima kasus) merupakan analit lain yang ditemukan pada ketiun.

4. Kesimpulan

Sebuah metode GC-MS-MS baru telah diusulkan untuk menentukan 31 pestisida yang sering ditemukan di Almeria (Spanyol) dalam sampel buah dan syuran segar. Penggunaan Carbofrit dalam injektor liner gelas mengurangi jumlah senyawa volatil dari matriks yang mencapai kolom analitik dan meningkatkan injeksi volume besar (10 μL) ekstrak. Penggunaan MS-MS telah membuktikan kapabilitasnya untuk meningkatkan selektivitas pendeteksian dan kuantifikasi termasuk informasi kuantitatif yang bermanfaat untuk konfirmasi hasil. Dengan cara ini, tahapan pembersihan tidak harus mengurangi biaya, waktu, dan ketidakpastian. Metode ini sangat cocok untuk analisis rutin. Sekitar 8000 sampel dari berbagai jenis buah dan syuran yang ditumbuhkan di rumah kaca el Ejido (Almeria, Spanyol) dianalisis dengan metode yang diusulkan ini dan menemukan bahwa kurang dari 0,5% sampel yang memiliki residu diatas ambang batas MRL Spanyol atau 1,4% diatas ambang batas MRL Uni Eropa.

0 comments:

Post a Comment

BlueDEX Ads
 
Bloggerized by Blogger Template