Urutan gen 18-kDa Mycobacterium leprae pada bagian hulu (upstream) menimbulkan aktivitas penghambatan transkripsi dengan cara yang tidak tergantung pada orientasi
Abstrak
Untuk memahami peranan area hulu dari gen 18-kDa Mycobacterium leprae dalam regulasi gen, area ini dibagi menjadi dua pada posisi -50 mulai dari kodon pertama gen dan efeknya terhadap transkripsi diperiksa dengan menggunakan uji gen reporter transkripsonal LacZ. Keberadaan masing-masing dari dua area ini menimbulkan penghambatan transkripsi tidak hanya terhadap promoter gen 18-kDa M. leprae, tetapi juga terhadap promoter heterolog seperti promoter gen BCG hsp65 Mycobacterium. Lebih daripada itu, ditemukan bahwa area-area ini bisa menimbulkan aktivitas penghambatan transkripsi pada kedua kasus dengan cara yang tidak tergantung orientasi. Sehingga, hasil-hasil ini menandakan bahwa area hulu dari gen 18-kDa M. leprae membawa unsur responsif penghambatan transkripsi yang bertindak sebagai sebuah operator dan bisa dibagi lebih lanjut menjadi dua area fungsional secara terpisah, sehingga menunjukkan struktur elemen yang terdiri dari dua bagian. Pengidentifikasian aktivitas penghambatan transkripsi oleh area hulu pada gen 18-kDa M. leprae akan memberikan tambahan pengetahuan yang signifikan dalam memahami mekanisme regulasi gen 18-kDa, dan juga memberikan informasi bermanfaat untuk manipulasi ekspresi gen mycobacterium.
Pendahuluan
Mycobacterium leprae, yang merupakan agen kausatif kusta, masih tetap menjadi salah satu bakteri patogen utama yang menyebabkan masalah-masalah kesehatan di seluruh dunia khususnya di negara-negara berkembang. M. leprae tidak bisa dibiakkan secara in vitro, akan tetapi, ia bertahan hidup dan berkembang dalam sel-sel makrofage host dengan mengelakkan aktivitas bakterisida dari sel-sel makrofage ini, walaupun mekanisme pastinya masih perlu diteliti. Untuk memahami mekanisme imunopatologi dari patogen ini dan untuk mengembangkan kandidat vaksin yang efektif, banyak kajian biologi molekuler yang telah dilakukan untuk mengidentifikasi dan mengkarakterisasi protein-protein antigenik imunodominan dari M. leprae (Hunter dkk., 1990; Rivoire dkk., 1994; Pessolani dan Brennan, 1996). Beberapa gen yang telah diidentifikasi untuk antigen-antigen ini juga telah berhasil dikloning dan diurutkan (Thole dkk., 1995). Diantaranya, sebuah antigen 18-kDa, yang merupakan anggota dari kelompok protein kejut panas (HSP), diketahui spesifik bagi M. leprae. Gen 18-kDa secara khusus teraktivasi selama pertumbuhan intraseluler dan bisa terlibat dalam kelangsungan hidup M. leprae dalam makrofage (Dellagostin dkk., 1995).
Beberapa gen bakteri yang teraktivasi selama memasuki sel host penting untuk kelangsungan hidup dan patogenesisnya. Sehingga, pengidentifikasian mekanisme aktivasi gen 18-kDa yang spesifik M. leprae akan menjadi penting untuk memahami biologi molekuler dan patogenesis M. leprae secara lebih baik. Akan tetapi, mekanisme rincinya belum diketahui.
Baru-baru ini, dengan menggunakan analisis pemetaan penghapusan (deletion) kami telah menemukan bahwa area hulu (upstream) dari gen 18-kDa mengandung sebuah urutan yang bertanggung jawab untuk penghambatan transkripsi, yang jika dihapus akan menyebabkan aktivasi transkripsi dalam sebuah uji gen reporter transkripsi. Dalam penelitian ini, kami melaporkan bahwa area hulu (upstream) bisa dibagi lagi menjadi dua area fungsional terpisah yang dapat beroperasi sebagai elemen responsif penghambatan transkripsi dengan cara yang tidak tergantung orientasi. Hasil menunjukkan bahwa elemen responsif penghambatan transkripsi dalam gen 18-kDa bisa bertindak sebagai sebuah operator dan bisa tersusun atas elemen 2 bagian.
Hasil dan Pembahasan
Pengidentifikasian aktivitas penghambatan transkripsi oleh area hulu (upstream) dari gen 18-kDa M. leprae
Gen 18-kDa M. leprae mengandung sekitar 80 urutan pasangan basa yang terletak di bagian hulu kodon inisiasi translasi pertama dari gen tersebut, seperti ditunjukkan pada Gambar 1. Sebelumnya, telah ditemukan bahwa penghapusan urutan di bagian hulu ini menghasilkan aktivasi transkripsi yang signifikan dalam uji fusi transkripsi yang menggunakan LacZ sebagai gen reporter (ditunjukkan seperti pada kasus PM4GAL), sehingga menandakan bahwa ekspresi gen 18-kDa bisa dikendalikan oleh unsur-unsur responsif penghambatan transkripsi yang termuat dalam urutan di bagian hulu. Dari pemeriksaan kami terhadap urutan di bagian hulu gen 18-kDa yang dilaporkan sebelumnya (Booth dkk., 1988), ia mengandung urutan palindrom putatif dengan kemungkinan simetri ganda (CTATgTAG (N)10 CTATaTAG, yang bisa dipisahkan pada sekitar posisi -50 dari urutan hulu. Untuk membuktikan daya-respons penghambatan transkripsi pada area hulu dari gen 18-kDa, area ini dibagi menjadi dua bagian yaitu: posisi -81 sampai -50 dan posisi -52 sampai -2 dari urutan hulu, dan diisolasi secara terpisah serta ditempatkan pada bagian hilir urutan Pribnow box dari gen 18-kDa yang terdapat dalam vektor pM4GAL, yang menghasilkan masing-masing vektor pM4-OF dan pM4-OB. Aktivitas beta-galaktosidase dari vektor-vektor ini menghasilkan konstruk serta vektor kontrol selanjutnya ditentukan setelah transformasi menjadi turunan M. smegmatis mc2 155, yang merupakan mycobacterium pertumbuhan-cepat yang banyak digunakan dalam berbagai kajian genetika molekuler mycobacteria, sebagai sebuah host wakil untuk M. leprae yang dapat dibiakkan. Pada pM4-OF dan pM4-OB, seperti yang ditemukan sebelumnya dengan vektor reporter yang mengandung urutan upstream panjang-penuh 80-bp, aktivitas gen reporternya ditemukan tertekan secara dramatis mulai dari kadar pM4GAL sampai kadar pM0GAL yang hampir sama, yang mana merupakan vektor LacZ tanpa promoter sebagai sebuah vektor kontrol negatif (Gambar 2). Hasil menunjukkan bahwa bukan hanya daerah -81 sampai -50 tetapi juga posisi -52 sampai -2 dari urutan upstream yang bisa menimbulkan aktivitas penekanan transkripsi. Dengan demikian, unsur responsif penghambatan transkripsi dalam area hulu gen 18-kDa M. leprae paling besar kemungkinannya membentang sekitar posisi -50 dari urutan hulu, tetapi bisa terpisah secara fungsional pada titik tersebut.
Elemen responsif penghambatan transkripsi mampu berfungsi dengan cara yang tidak tergantung orientasi
Elemen responsif penghambatan transkripsi, seperti sebuah operator, diketahui bertindak dengan cara yang tidak tergantung orientasi pada kebanyakan kasus. Efek kedua area yang terletak dalam orientasi terbalik pada aktivitas penghambatan transkripsi juga diuji. Vektor pM4-OF (-) dan pM4-OB(-), dimana area -81 sampai -50 dan -52 sampai -2 dari urutan hulu dalam vektor pM4-PF dan pM4-OB terbalik, disusun dan dianalisis tingkat ekspresi beta-galaktosidasenya. Seperti ditunjukkan pada Gambar 3, kadar penghambatan transkripsional baik dengan pM4-OF (berorientasi ke depan) atau pM4-OF(-) (berorientasi ke belakang) sama-sama tertekan dibanding dengan pM4GAL. Kadar aktivitas beta-galaktosidase dengan seri vektor pM4-OB(-) yang mengandung unsur lain (-52 sampai -2) lagi dalam orientasi ke depan atau orientasi terbalik, masing-masing, juga ditemukan berkurang sama besarnya. Jika digabungkan, hasil-hasil ini menunjukkan bahwa unsur-unsur pengaturan transkripsi dalam area hulu dari gen 18-kDa bisa memberikan aktivitas penghambatan transkripsi dengan cara yang tidak tergantung orientasi.
Pengaruh elemen pengaturan transkripsi pada urutan hulu dari gen 18-kDa M. leprae terhadap promoter homolog
Untuk lebih membuktikan aktivitas penghambatan transkripsi oleh elemen-elemen pengaturan transkripsi dalam bagian hulu gen 18-kDa M. leprae, kami menguji apakah elemen-elemen ini juga bisa menimbulkan penghambatan transkripsi pada promoter heterolog lain. Vektor reporter beta-galaktosidase yang dikendalikan oleh promoter gen BCG hsp65 M. bovis dibuat dan disebut pM0GAL-BCG, serta pB3 dan pB3(-), sebuah turunan dari pM0GAL-BCG, dimana urutan hulu -81 sampai -50 dari gen 18-kDa M. leprae ditempatkan langsung di bagian hilir urutan promoter gen BCG hsp65 M. bovis masing-masing pada orientasi ke depan dan ke belakang. Pengukuran aktivitas beta-galaktosidase dengan vektor-vektor ini menunjukkan bahwa urutan hulu dari gen 18-kDa M. leprae pada kedua orientasi (ke depan dan ke belakang) bisa secara efektif menekan aktivitas promoter gen BCG hsp65 M. bovis (dibanding dengan seri pB3 untuk pM0GAL-BCG pada Gambar 4). Analisis serupa dengan elemen pengaturan transkripsi lain pada urutan -52 sampai -2 dari daerah hulu gen 18-kDa menunjukkan pengaruh yang sama (data tidak ditunjukkan). Sebagai kesimpulan, hasil-hasil ini menunjukkan bahwa elemen penghambatan transkripsi pada urutan gen 18-kDa M. lerprae di bagian hulu (upstream) juga bisa berfungsi pada promoter heterolog dan bisa bertindak dengan cara yang tidak tergantung orientasi seperti sebuah elemen operator untuk penghambatan transkripsi. Pengidentifikasian aktivitas penghambatan transkripsi area hulu dalam gen 18-kDa M. leprae ini akan menjadi penting dan memberikan tambahan pengetahuan untuk memahami mekanisme regulasi gen 18-kDa serta memberikan informasi bermanfaat untuk manipulasi ekspresi gen mycobacterium di masa mendatang.
Untuk memahami peranan area hulu dari gen 18-kDa Mycobacterium leprae dalam regulasi gen, area ini dibagi menjadi dua pada posisi -50 mulai dari kodon pertama gen dan efeknya terhadap transkripsi diperiksa dengan menggunakan uji gen reporter transkripsonal LacZ. Keberadaan masing-masing dari dua area ini menimbulkan penghambatan transkripsi tidak hanya terhadap promoter gen 18-kDa M. leprae, tetapi juga terhadap promoter heterolog seperti promoter gen BCG hsp65 Mycobacterium. Lebih daripada itu, ditemukan bahwa area-area ini bisa menimbulkan aktivitas penghambatan transkripsi pada kedua kasus dengan cara yang tidak tergantung orientasi. Sehingga, hasil-hasil ini menandakan bahwa area hulu dari gen 18-kDa M. leprae membawa unsur responsif penghambatan transkripsi yang bertindak sebagai sebuah operator dan bisa dibagi lebih lanjut menjadi dua area fungsional secara terpisah, sehingga menunjukkan struktur elemen yang terdiri dari dua bagian. Pengidentifikasian aktivitas penghambatan transkripsi oleh area hulu pada gen 18-kDa M. leprae akan memberikan tambahan pengetahuan yang signifikan dalam memahami mekanisme regulasi gen 18-kDa, dan juga memberikan informasi bermanfaat untuk manipulasi ekspresi gen mycobacterium.
Pendahuluan
Mycobacterium leprae, yang merupakan agen kausatif kusta, masih tetap menjadi salah satu bakteri patogen utama yang menyebabkan masalah-masalah kesehatan di seluruh dunia khususnya di negara-negara berkembang. M. leprae tidak bisa dibiakkan secara in vitro, akan tetapi, ia bertahan hidup dan berkembang dalam sel-sel makrofage host dengan mengelakkan aktivitas bakterisida dari sel-sel makrofage ini, walaupun mekanisme pastinya masih perlu diteliti. Untuk memahami mekanisme imunopatologi dari patogen ini dan untuk mengembangkan kandidat vaksin yang efektif, banyak kajian biologi molekuler yang telah dilakukan untuk mengidentifikasi dan mengkarakterisasi protein-protein antigenik imunodominan dari M. leprae (Hunter dkk., 1990; Rivoire dkk., 1994; Pessolani dan Brennan, 1996). Beberapa gen yang telah diidentifikasi untuk antigen-antigen ini juga telah berhasil dikloning dan diurutkan (Thole dkk., 1995). Diantaranya, sebuah antigen 18-kDa, yang merupakan anggota dari kelompok protein kejut panas (HSP), diketahui spesifik bagi M. leprae. Gen 18-kDa secara khusus teraktivasi selama pertumbuhan intraseluler dan bisa terlibat dalam kelangsungan hidup M. leprae dalam makrofage (Dellagostin dkk., 1995).
Beberapa gen bakteri yang teraktivasi selama memasuki sel host penting untuk kelangsungan hidup dan patogenesisnya. Sehingga, pengidentifikasian mekanisme aktivasi gen 18-kDa yang spesifik M. leprae akan menjadi penting untuk memahami biologi molekuler dan patogenesis M. leprae secara lebih baik. Akan tetapi, mekanisme rincinya belum diketahui.
Baru-baru ini, dengan menggunakan analisis pemetaan penghapusan (deletion) kami telah menemukan bahwa area hulu (upstream) dari gen 18-kDa mengandung sebuah urutan yang bertanggung jawab untuk penghambatan transkripsi, yang jika dihapus akan menyebabkan aktivasi transkripsi dalam sebuah uji gen reporter transkripsi. Dalam penelitian ini, kami melaporkan bahwa area hulu (upstream) bisa dibagi lagi menjadi dua area fungsional terpisah yang dapat beroperasi sebagai elemen responsif penghambatan transkripsi dengan cara yang tidak tergantung orientasi. Hasil menunjukkan bahwa elemen responsif penghambatan transkripsi dalam gen 18-kDa bisa bertindak sebagai sebuah operator dan bisa tersusun atas elemen 2 bagian.
Hasil dan Pembahasan
Pengidentifikasian aktivitas penghambatan transkripsi oleh area hulu (upstream) dari gen 18-kDa M. leprae
Gen 18-kDa M. leprae mengandung sekitar 80 urutan pasangan basa yang terletak di bagian hulu kodon inisiasi translasi pertama dari gen tersebut, seperti ditunjukkan pada Gambar 1. Sebelumnya, telah ditemukan bahwa penghapusan urutan di bagian hulu ini menghasilkan aktivasi transkripsi yang signifikan dalam uji fusi transkripsi yang menggunakan LacZ sebagai gen reporter (ditunjukkan seperti pada kasus PM4GAL), sehingga menandakan bahwa ekspresi gen 18-kDa bisa dikendalikan oleh unsur-unsur responsif penghambatan transkripsi yang termuat dalam urutan di bagian hulu. Dari pemeriksaan kami terhadap urutan di bagian hulu gen 18-kDa yang dilaporkan sebelumnya (Booth dkk., 1988), ia mengandung urutan palindrom putatif dengan kemungkinan simetri ganda (CTATgTAG (N)10 CTATaTAG, yang bisa dipisahkan pada sekitar posisi -50 dari urutan hulu. Untuk membuktikan daya-respons penghambatan transkripsi pada area hulu dari gen 18-kDa, area ini dibagi menjadi dua bagian yaitu: posisi -81 sampai -50 dan posisi -52 sampai -2 dari urutan hulu, dan diisolasi secara terpisah serta ditempatkan pada bagian hilir urutan Pribnow box dari gen 18-kDa yang terdapat dalam vektor pM4GAL, yang menghasilkan masing-masing vektor pM4-OF dan pM4-OB. Aktivitas beta-galaktosidase dari vektor-vektor ini menghasilkan konstruk serta vektor kontrol selanjutnya ditentukan setelah transformasi menjadi turunan M. smegmatis mc2 155, yang merupakan mycobacterium pertumbuhan-cepat yang banyak digunakan dalam berbagai kajian genetika molekuler mycobacteria, sebagai sebuah host wakil untuk M. leprae yang dapat dibiakkan. Pada pM4-OF dan pM4-OB, seperti yang ditemukan sebelumnya dengan vektor reporter yang mengandung urutan upstream panjang-penuh 80-bp, aktivitas gen reporternya ditemukan tertekan secara dramatis mulai dari kadar pM4GAL sampai kadar pM0GAL yang hampir sama, yang mana merupakan vektor LacZ tanpa promoter sebagai sebuah vektor kontrol negatif (Gambar 2). Hasil menunjukkan bahwa bukan hanya daerah -81 sampai -50 tetapi juga posisi -52 sampai -2 dari urutan upstream yang bisa menimbulkan aktivitas penekanan transkripsi. Dengan demikian, unsur responsif penghambatan transkripsi dalam area hulu gen 18-kDa M. leprae paling besar kemungkinannya membentang sekitar posisi -50 dari urutan hulu, tetapi bisa terpisah secara fungsional pada titik tersebut.
Elemen responsif penghambatan transkripsi mampu berfungsi dengan cara yang tidak tergantung orientasi
Elemen responsif penghambatan transkripsi, seperti sebuah operator, diketahui bertindak dengan cara yang tidak tergantung orientasi pada kebanyakan kasus. Efek kedua area yang terletak dalam orientasi terbalik pada aktivitas penghambatan transkripsi juga diuji. Vektor pM4-OF (-) dan pM4-OB(-), dimana area -81 sampai -50 dan -52 sampai -2 dari urutan hulu dalam vektor pM4-PF dan pM4-OB terbalik, disusun dan dianalisis tingkat ekspresi beta-galaktosidasenya. Seperti ditunjukkan pada Gambar 3, kadar penghambatan transkripsional baik dengan pM4-OF (berorientasi ke depan) atau pM4-OF(-) (berorientasi ke belakang) sama-sama tertekan dibanding dengan pM4GAL. Kadar aktivitas beta-galaktosidase dengan seri vektor pM4-OB(-) yang mengandung unsur lain (-52 sampai -2) lagi dalam orientasi ke depan atau orientasi terbalik, masing-masing, juga ditemukan berkurang sama besarnya. Jika digabungkan, hasil-hasil ini menunjukkan bahwa unsur-unsur pengaturan transkripsi dalam area hulu dari gen 18-kDa bisa memberikan aktivitas penghambatan transkripsi dengan cara yang tidak tergantung orientasi.
Pengaruh elemen pengaturan transkripsi pada urutan hulu dari gen 18-kDa M. leprae terhadap promoter homolog
Untuk lebih membuktikan aktivitas penghambatan transkripsi oleh elemen-elemen pengaturan transkripsi dalam bagian hulu gen 18-kDa M. leprae, kami menguji apakah elemen-elemen ini juga bisa menimbulkan penghambatan transkripsi pada promoter heterolog lain. Vektor reporter beta-galaktosidase yang dikendalikan oleh promoter gen BCG hsp65 M. bovis dibuat dan disebut pM0GAL-BCG, serta pB3 dan pB3(-), sebuah turunan dari pM0GAL-BCG, dimana urutan hulu -81 sampai -50 dari gen 18-kDa M. leprae ditempatkan langsung di bagian hilir urutan promoter gen BCG hsp65 M. bovis masing-masing pada orientasi ke depan dan ke belakang. Pengukuran aktivitas beta-galaktosidase dengan vektor-vektor ini menunjukkan bahwa urutan hulu dari gen 18-kDa M. leprae pada kedua orientasi (ke depan dan ke belakang) bisa secara efektif menekan aktivitas promoter gen BCG hsp65 M. bovis (dibanding dengan seri pB3 untuk pM0GAL-BCG pada Gambar 4). Analisis serupa dengan elemen pengaturan transkripsi lain pada urutan -52 sampai -2 dari daerah hulu gen 18-kDa menunjukkan pengaruh yang sama (data tidak ditunjukkan). Sebagai kesimpulan, hasil-hasil ini menunjukkan bahwa elemen penghambatan transkripsi pada urutan gen 18-kDa M. lerprae di bagian hulu (upstream) juga bisa berfungsi pada promoter heterolog dan bisa bertindak dengan cara yang tidak tergantung orientasi seperti sebuah elemen operator untuk penghambatan transkripsi. Pengidentifikasian aktivitas penghambatan transkripsi area hulu dalam gen 18-kDa M. leprae ini akan menjadi penting dan memberikan tambahan pengetahuan untuk memahami mekanisme regulasi gen 18-kDa serta memberikan informasi bermanfaat untuk manipulasi ekspresi gen mycobacterium di masa mendatang.
Comments
Post a Comment