Primer-primer PCR yang dapat mendeteksi DNA Mycobacterium leprae dalam kadar rendah

Thursday, December 24, 2009

Abstrak

Ada beberapa metode berbasis PCR-spesifik untuk mendeteksi DNA Mycobacterium leprae, tetapi amplikon DNA cukup besar. Sebagai contoh, primer-primer yang menargetkan gen antigen 36-kDa dan digunakan secara umum untuk tujuan diagnostik menghasilkan produk 530-bp. Ini bisa menjadi kekurangan ketika menguji sampel-sampel dimana DNA kemungkinan rusak dan terfragmentasi. Dengan demikian, dua kelompok primer nested spesifik M. leprae dirancang, berdasarkan pasangan-pasangan primer yang ada, yang telah terbukti spesifik untuk M. leprae. Primer-primer yang menargetkan gen antigen 18-kDa memberikan produk luar 136 bp dan produk dalam 110 bp. Primer-primer yang didasarkan pada sekuensi berulang TLEP menghasilkan produk luar 129-bp dan produk nested 99-bp. Dengan pengenceran siapan sel-utuh dari M. leprae sebagai sumber DNA, PCR tahapan tunggal dan PCR nested dilakukan setelah pengoptimalan kondisi-kondisi eksperimental. Jika dibandingkan dengan primer-primer gen antigen 36-kDa, primer luar gen antigen 18-kDa 100-kali lipat lebih sensitif dan primer luar RLEP 1000-kali lipat lebih sensitif. Sebagai ilustrasi dari dua pengaplikasian yang mungkin untuk primer-primer baru ini, hasil positif didapatkan dari tiga sampel skin slit dari pasien kusta lepromatous yang dirawat dan tiga sampel dari manusia yang tetap menunjukkan palaeopatologi kusta tipikal. Disimpulkan bahwa primer-primer baru ini merupakan sebuah sarana yang bermanfaat untuk mendeteksi DNA M. leprae yang rusak atau terdapat dalam kadar yang sangat rendah.


Pendahuluan

Mycobacterium leprae, agen penyebab kusta, merupakan salah satu dari beberapa bakteri patogen yang diketahui, yang mana tidak dapat dibiakkan secara in vitro. Diagnosis penyakit didasarkan pada pemeriksaan klinis pasien, histopatologi dan penunjukkan basilus tahan asam dalam hapusan atau biopsi skin-slit. Akan tetapi, batas deteksi berdasarkan mikroskop adalah c. 104 basilus/mL. Untuk meningkatkan kesensitifan dan kespesifikan pendeteksian M. leprae, beberapa peneliti telah melaporkan metode-metode berdasarkan PCR. Metode-metode ini menargetkan bagian genom M. leprae yang berbeda dan menghasilkan amplikon-amplikon yang relatif besar (320 – 530 bp) dibanding dengan yang digunakan secara rutin untuk pendeteksian M. tuberculosis (123 bp).

Primer-primer yang dirancang oleh Hartskeerl dkk. didasarkan pada gen antigen 36-kDa dan masih digunakan oleh banyak laboratorium. Walaupun amplikonnya memiliki ukuran 530-bp, para peneliti melaporkan bahwa model ini memungkinkan pendeteksian bakterium tunggal. Williams dkk menggunakan primer untuk gen antigen 18-kDa M. leprae yang menghasilkan sebuah produk 360-bp dan dapat mendeteksi sedikitnya 100 M. leprae dalam siapan biopsi kulit manusia tidak-terinfeksi yang dibiakkan. Plikaytis dkk. melaporkan sebuah reaksi PCR dua-tahapan nested yang mengamplifikasi produk luar 578-bp dan produk dalam 347-bp dari groEL M. leprae (antigen 65-kDa) dan dapat mendeteksi sedikitnya 3 fg DNA, yang bisa sama dengan jumlah yang ditemukan dalam sebuah basilus tunggal. Woods dan Cole mendasarkan PCR mereka terhadap sebuah elemen berulang spesifik-M. Leprae (RLEP), yang ditemukan oleh Yoon dkk dapat mendeteksi DNA M. leprae pada 73% pasien dengan indeks bakteri (BI) sama dengan 0. PCR yang berbasis RLEP ini dikembangkan lebih lanjut oleh Santos dkk. Para peneliti ini mengoptimalkan ekstraksi DNA dari sampel-sampel klinis dan, dengan inklusi hibridisasi DNA, mampu mendeteksi 100 ag (10-16) DNA target, yang ekivalen dengan sekitar sepersepuluh genom bakteri. Amplikon pada kasus ini adalah 372 bp. PCR dua-tahapan nested yang didasarkan pada urutan berulang RLEP dikembangkan oleh Jamil dkk dengan produk luar 455 bp dan produk dalam 320 bp.

Akan tetapi, semua metode PCR yang spesifik M. leprae ini menghaslkan amplikon yang cukup besar. Pasien yang dirawat bisa terus membawa DNA M. leprae, khususnya pada kasus pasien lanjut usia yang mendapatkan monoterapi dapson. Bahkan perawatan dengan rifampicin, yang membunuh organisme dengan cepat, menghasilkan degradasi DNA dalam periode 2-3 bulan dan telah dianjurkan bahwa DNA residual ini bisa memegang peranan dalam reaksi akhir. Dengan demikian, penting agar DNA residual dapat dideteksi.

DNA terdegradasi dengan cepat setelah kematian dan terfragmentasi dari waktu ke waktu. Dengan demikian, spesimen-spesimen arkeologis kemungkinan mengandung DNA terfragmentasi dan c. 200bp telah dianggap sebagai ukuran maksimum DNA mamalia yang dapat diamplifikasi dari sampel-sampel kuno. Semakin banyak yang tertarik terhadap penggunaan PCR untuk mendeteksi keberadaan patogen bakteri dalam material arkeologis manusia, dan M. tuberculosis dan M. leprae telah ditunjukkan dalam spesimen-spesimen yang berasal dari lebih 1000 tahun yang lalu.

DNA mycobakteri kemungkinan lebih terlindungi dibanding DNA dari organisme lain, karena dinding sel kaya lipid yang hidrofob. Dinding sel M. leprae bahkan lebih tebal dibanding M. tuberculosis, sehingga bisa diantisipasi untuk memberikan perlindungan yang leih besar terhadap DNA mikroba didalamnya. Bahkan demikian, semakin kecil urutan target DNA, semakin besar kemungknan pendeteksian DNA yang telah rusak oleh terapi antimikroba atau seiring dengan berjalannya waktu.

Tujuan penelitian ini adalah untuk merancang primer-primer, berdasarkan yang saat ini digunakan dan diketahui spesifik M. leprae, tetapi dengan urutan target yang lebih kecil dibanding yang dilaporkan sebelumnya, yang akan cocok untuk digunakan dengan pasien kusta yang dirawat, sampel-sampel yang kemungkinan mengandung DNA terdegradasi atau terfragmentasi, dan spesimen-spesimen arkeologis.

Pembahasan

Dua pasangan primer nested digunakan untuk mengamplifikasi DNA M. leprae dari reagen uji kulit lepromin, sampel dari pasien kusta yang memiliki BI sama dengan nol, dan dari tiga diantara enam spesimen arkeologis yang berasal dari abad ke-10 – ke-11. PCR nested meningkatkan sensitifitas PCR karena memungkinkan total 50 siklus amplifikasi untuk digunakan, tetapi menghindari artefak amplifikasi berlebihan. Hanya dengan PCR nested berbasis primer RLEP dimana ketiga sampel klinis ditemukan memberikan hasil positif. Tidak diketahui apakah DNA M. leprae residual memiliki signifikansi klinis, sehingga bisa diinginkan untuk menggunakan primer-primer ini, yang dapat mendeteksi jumlah DNA M. leprae yang lebih rendah dibanding yang dibolehkan oleh metode sekarang, dalam penelitian-penelitian longitudinal terhadap pasien-pasien kusta yang diobati.

Ketiga sampel arkeologis positif diambil dari cavum nasale. Diketahui bahwa M. leprae terlokalisasi ke sel-sel Schwann dan sel-sel epitelium hidung, dan sehingga ini dapat menghasilkan rhinitis yang terkait dengan sangat tingginya jumlah organisme. Tiga spesimen cavum nasale menunjukkan palaeopatologi tipikal yang terkait dengan kusta, sehingga ada kemungkinan bahwa DNA M. leprae ada pada sampel-sampel ini saat kematian host. Pendeteksian M. leprae pada spesimen yang berusia >1000 tahun dilaporkan sebelumnya dalam laporan pendahuluan dan pengamatan-pengamatan tambahan ini, ditambah data sekuensi DNA, menguatkan adanya DNA M. leprae. Kusta merupakan penyakit yang utamanya mengenai saraf perifer dan kulit, meski juga dapat mengenai tulang. Akan tetapi, ketiadaan DNA M. leprae yang dapat dideteksi dalam spesimen metatarsal (A2, A5) dan sampel fibula (A6) tidak harus menunjukkan bahwa sisanya berasal dari individu yang tidak mengalami penyakit. Walaupun banyak kerangka yang telah ditemukan dengan perubahan-perubahan yang terkait dengan kusta lepromatous, tulang-tulang perifer kemungkinan mengandung relatif sedikit DNA M. leprae dibanding dengan daerah nasal. Lebih lanjut, kebanyakan pengamat mempertimbangkan perubahan pada tungkai akibat infeksi sekunder, yang merupakan hasil dari kehilangan sensasi akibat kerusakan saraf oleh organisme, sehingga beberapa tungkai yang terkena bisa tidak mengandung lagi DNA M. leprae sama sekali.

Semua primer baru memiliki sensitifitas yang lebih besar dibanding primer yang umum digunakan seperti dilaporkan oleh Hartskeerl dkk. dan memungkinkan spesimen arkeologis positif M. leprae dideteksi dengan tahapan tunggal disamping PCR nested. Salah satu alasan untuk perbedaan ini adalah ukuran target yang lebih kecil, karena ini lebih besar kemungkinannya menghasilkan uji PCR yang berhasil terhadap DNA yang rusak dan terfragmentasi. Primer yang paling sensitif didasarkan pada sekuensi berulang (RLEP), yang berulang 28 kali dalam kromosom M. leprae. Primer-primer didasarkan pada gen antigen 18-kDa, yang terdapat sebagai salinan tunggal per sel, adalah 10 kali kurang sensitif, sedangkan primer Hartskeerl, yang menghasilkan produk 530-bp, 1000 kali lipat kurang sensitif. Reagen lepromin mengandung 109 organisme/mL, tetapi tidak diketahui apakah semua DNA tersedia untuk amplifikasi. Dengan demikian, dihitung bahwa primer LP1/LP2, dalam PCR tahapan-tunggal dengan 45 siklus amplifikasi, yang dideteksi pada sekurang-kurangnya 0,3 sebuah organisme, dan sangat mungkin bahwa sensitifitas masih lebih besar.

Disimpulkan bahwa primer-primer yang baru ditemukan ini memiliki sensitifitas yang lebih besar dalam pendeteksian DNA M. leprae pada sampel-sampel dimana kuantitas dan kualitas DNA residual kemungkinan rendah. Pengaplikasian yang sesuai untuk primer-primer ini bisa pada penelitian-penelitian longitudinal terhadap pasien-pasien kusta yang dirawat, dan penyelidikian paleopatologi.

0 comments:

Post a Comment

BlueDEX Ads
 
Bloggerized by Blogger Template