Mutasi OSMRβ (Reseptor Oncostatin M -β) Mendasari Terjadinya FPLCA (Amyloidosis Kutaneous Terlokalisasi Primer Familial)
Amyloidosis kutaneous terlokalisasi primer familial (FPLCA) merupakan sebuah gangguan dominan autosomal yang terkait dengan gatal-gatal kronis pada kulit dan deposisi materia amyloid terkait-filamen dalam dermis. FPLCA telah dipetakan pada 5p13.1-q11.2, dan dengan menggunakan analisis gen kandidat, telah berhasil diidentifikasi mutasi-mutasi missens dalam gen OSMR, yang mengkodekan OSMRβ (reseptor spesifik oncostatin M β), pada tiga keluarga. OSMRβ merupakan sebuah komponen dari reseptor tipe II oncostatin M (OSM) dan reseptor interleukin (IL)-31, dan keratinosit FPLCA yang dikulturkan menunjukkan penurunan aktivasi jalur Jak/STAT, MAPK, dan P13K/Akt setelah stimulasi dengan OSM atau sitokin IL-31. Substitusi asam amino patogenik terletak dalam domain mirip fibronektin tipe III ekstraseluler (FNIII), daerah-daerah yang penting bagi dimerisasi dan fungsi reseptor. Pensinyalan OSM dan IL-31 telah ditemukan terlibat dalam proliferasi, diferensiasi, apoptosis, dan inflamasi sel keratinosit, tetapi data OSMR kami dengan FPLCA merupakan mutasi germline manusia pertama dalam kompeks reseptor sitokin ini dan memberikan pengetahuan baru tentang mekanisme gatal-gatal pada kulit.
Pendahuluan
Salah satu gejala yang paling umum dan paling sukar dipahami dalam dermatologi adalah kulit yang gatal (yang juga disebut sebagai pruritus). Sampai sekarang, masih relatif sedikit yang diketahui tentang mediator inti dalam terjadinya gatal-gatal, reseptor-reseptor, dan jalur-jalur, serta terapi efektif untuk menghindari gejala-gejala gatal masih terbatas. Salah satu gangguan kulit pruritus yang sering ditemukan oleh para dermatologist adalah amyloidosis kutaneous terlokalisasi primer (PLCA). Kondisi ini biasanya disertai dengan gatal-gatal (khususnya pada betis bawah) dan perubahan hiperpigmentasi dan penebalan kulit yang dapat terlihat (lichenifikasi) yang bisa diperburuk oleh penggarukan terus menerus. PLCA tidak terkait dengan bentuk amyloidosis sistemik lainnya; kulit pada PLCA menunjukkan degenerasi keratinosit basal fibrillary dengan peningkatan apoptosis, penggangguan serat-serat saraf yang tidak mengalami myelinasi, dan akumulasi melanosom dalam makrofage dermal dan sel-sel Schwann. Amyloid pada PLCA kemungkinan menunjukkan kombinasi filamen-filamen keratin, komponen amyloid P serum, dan deposisi sekunder imunoglobulin. Meskipun demikian, PLCA belum dilaporkan terjadi bersama dengan beberapa gangguan klinis lain seperti penyakit jaringan konektif (seperti lupus erythematosus sistemik, arthritis rheumatoid, skelrosis sistemik, skleroderma, sirosis hati primer, dan dermatomyositis) serta neoplasia endokrin ganda tipe 2A(MEN2A). PLCA pada beberapa individu yang mengalami MEN2A telah ditemukan terkait dengan substitusi asam amino spesifik dalam RET proto-oncogen (khususnya yang melibatkan kodon 634), tetapi tidk ada patologi gen RET yang telah ditemukan pada kasus PLCA tanpa adanya MED2A. Kebanyakan kasus klinis PLCA bersifat sporadis tetapi gangguan ini lebih umum pada beberapa daerah tertentu di dunia, termasuk Amerika Selatan dan Asia Tenggara, dimana sampai 10% kasus bisa diwariskan dalam keluarga (dominan autosomal). Akan tetapi, heterogeneitas genetik diduga karena scan genome-wide terbaru untuk PLCA familial (FPLCA) di Taiwan telah menunjukkan rangkai-genetika terhadap 1q23 atau 5p13. 1-q11.2 atau kemungkinan lokus yang tidak ditemukan lainnya, dengan skor LOD yang palign signifikan untuk lokus penyakit pada 5. Dengan demikian, pengidentifikasian gen untuk FPLCA bisa diharapkan memberikan pengetahuan baru tentang mekanisme patofisiologi tertentu yang mendasari gatal-gatal kulit, inflamasi, dan apoptosis keratinosit.
Dalam penelitian ini, kami memetakan sebuah keluarga Brazil dengan FPLCA pada 5p13.1-q11.2 dan melakukan analisis gen kandidat dengan mengurutkan DNA genomik. Kami menemukan mutasi missens dalam gen OSMR, yang mengkodekan OSMRβ, pada semua individu yang terkena dari keluarga FPLCA Brazil. Penyelidikan lebih lanjut pada dua keluarga kulit putih lainnya yang mengalami FPLCA (dari Inggris dan Afrika Selatan) juga menunjukkan mutasi pada OSMR. Abnormalitas-abnormalitas pada pensinyalan OSMRβ setelah stimulasi dengan ligan OSM dan IL-31 ditunjukkan, sehingga memberikan data faktual untuk mendukung mutasi gen OSMR yang bertanggung jawab untuk FPLCA serta menghasilkan data baru tentang mekanisme pruritus dan apoptosis keratinosit pada kulit manusia.
Bahan dan Metode
Sampel DNA, Analisis Mikrosatelit, dan Sekuensing
Setelah mendapatkan persetujuan Komite Etik dan setelah mendapatkan izin dari semua subjek, DNA genomik diekstraksi dari sampel-sampel darah perifer yang didapatkan dari tiga keluarga FPLCA (I-1; II-3 sampai 6; III-1, 3 sampai 6, 8 sampai 17; IV-2 sampai 4, 6 sampai 9 Famili 1; tiga individu yang terkena dari Famili 2, dan dua individu yang terkena dari Famili 3). DNA diamplifikasi dengan lima set primer untuk penanda-penanda mikrosatelit yang terletak antara 5p13,2 dan 5q11,2 (Tabel 1). Primer-primer ini didapatkan dari ABI PRISM Linkage Mapping Set Version 2.5 (Applied Biosystem). Produk-produk PCR dianalisis pada sekuenser ABI 310 DNA dengan Genescan 2.1 dan Genotyper 2.0 (Applied Biosystem). Skor LOD 2-poin dihitung dengan algoritma M-LINK LINKAGE versi 5.1 dengan asumpi frekuensi alel mutan 0,00001 dan 100% rasuk genetik (penetrance). Analisis gen kandidat selanjutnya dilakukan. Untuk sekuensing, sampel-sampel DNA diamplifikasi dengan primer-primer yang terletak dalam intron yang mengapit ekson individual dari gen OSMR dan IL31RA, IL6ST, dan gen LIFR. Produk PCR diurutkan dengan reagen ABI Big Dye Terminator (Applied Biosystem) pada sekuensi ABI 310.
RT-PCR
mRNA diekstraksi dari spesimen-spesimen biopsi kulit individu III-16 dalam Famili 1 dan salah satu individu yang terkena dari Famili 2 dan 3, masing-masing, serta sampel kulit normal, dengan menggunakan alat QIAGEN beserta sintesis cDNA selanjutnya dengan Superscript II reverse transkriptase (Invitrogen). Primer-primer yang memiliki target di dekat ujung-3' dari cDNA digunakan untuk mengamplifikasi reseptor sitokin Tipe IL-6 dan ligan-ligan yang bersangkutan.
Pengisolasian Keratinosit dan Kultur
Kultur-kultur keratinosit primer diisolasi menurut prosedur standar. Secara ringkas, setelah disosiasi mekanis, fragmen-fragmen biopsi kulit dicelupkan selama 1 jam pada 37oC dalam larutan trypsin-EDTA. Larutan ini selanjutnya disaring melalui strainer sel pori 100 μm (VWR), dan kemudian medium yang disuplementasi dengan 10% serum janin sapi (FBS) ditambahkan untuk menetralisir trypsin. Sel-sel diisolasi dengan sentrifus (5 menit, 1000 rpm), dan bulatan yang terbentuk disuspensi ulang dalam medium keratinosit normal. Terakhir, sel-sel dibuakkan dalam gelas kimia T25 yang mengandung feeders. Keratinosit-keratinosit dipertahankan pada medium DMEM:Ham F21 yang disuplementasi dengan FBS 10%, 5 μg/mL transferrin, 0,4 μg/mL hidrokortison, 10-20 toksin kolera, 10 ng/mL faktor pertumbuhan epidermal (EGF) 1,5 μg/mL insulin, dan 2 x 10-11 M liothyronin. Sel-sel feeder NIH 3T3 yang diperlakukan dengan mitomycin C segar ditambahkan ke keratinosit primer dua kali sepekan. Keratinosit yang keluar lebih awal dinonaktifkan dengan HPV16 (E6^E7), seperti dijelaskan sebelumnya dalam literatur.
Stimulasi Sitokin
Keratinosit dibiakkan dalam plat 6-wadah dan ditumbuhkan sampai bergabung. Sel-sel dipertahankan dalam medium keratinosit normal selama 3-5 hari setelah penggabungan. Sebelum stimulasi sitokin, sel-sel dicuci dua kali dalam larutan saline berbufer fosfat (PBS) dan diinkubasi dalam medium bebas serum (invitrogen) baik selama 2 atau 24 jam. Kultur-kultur kemudian distimulasi dengan sitokin yang relevan selama 15 menit sebelum preparasi hasil lysis untuk imunoblotting. Sitokin-sitokin yang digunakan dalam penelitian ini adalah OSM rekombinan, IL-6 dan IL-31. Konsentrasi sitokin yang digunakan adalah 10, 50, dan 100 ng/mL untuk OSM dan 100 ng/mL untuk IL-6 dan IL-31.
Immunoblotting
Sel-sel dicuci satu kali dengan PBS dingin dan dilysis dengan buffer RIPA yang mengandung anti protease. Hasil lysis sel diperlakukan dengan 4%-12% NuPAGE Novex Bis-Tris Gel (Invitrogen). Protein-protein yang terfraksionasi ditransfer ke membran transfer nitroselulosa Hybond-ECL (Amersham Bioscience). Membran dihambat dengan 5% milk-TTBS non-lemak selama 2 jam pada suhu ruangan dan diinkubasi selama satu malam pada 4oC dengan antibodi primer yang relevan. Kompleks antibodi-antigen divisualisasikan dengan kemiluminesensi tertingkatkan (Amersham Bioscience), menurut instruksi pabrik. Kepadatan optik dari berkas pada blot dihitung dengan Image J software. Antbodi-antibodi primer yang digunakan adalah STAT1(42H3)(9175), STAT3(124H6)(9139), STAT5(3H7)(9358), p44/42 MAP Kinase (Erk1/2)(9102), Akt (9272), phospho-STAT1-Tyr701(9171), phospho-STAT3-Tyr705 , (9131), phospho-STAT5-Tyr694(9351), phospho-p44/42 MAPK- Thr202/Tyr204 (phosphor-Erk1/2; 9106), phospho-Akt-Ser473
(9271) (Cell Signaling Technology, Inc.). Antiodi-antibodi sekunder adalah imunoglobulin/HRP anti-mencit dari kambing poliklonal dan imunoglobulin/HRP anti-kelinci dari babi poliklonal (Dako Cytomation).
Hasil
Gambaran klinis dan histopatologis FPLCA
Sebanyak 16 subjek dari empat generasi keturunan Brazil diketahui mengalami FPLCA, dengan pewarisan dominan autosomal (Gambar 1A). Pada individu yang terkena, gejala-gejala lazimnya bermula selama masa anak-anak disertai pruritus parah pada betis bawah, yang mengarah pada lichenifikasi kulit (Gambar 1B dan 1C). Histopatologi kulit lesi menunjukkan banyaknya pigmentasi dan material eosinofilik amorf dalam dermis papiler (Gambar 1D), yang menunjukkan hasil uji positif untuk tioflavin-T, yang konsisten dengan deposisi amyloid (Gambar 1E). Rincian-rincian kliniko-patologi Famili 2 (Britis kulit putih) dan famili 3 (Afrika selatan kulit putih) dengan FPLCA dominan-autosomal tela dilaporkan sebelumnya.
Identifikasi OSMR sebagai Gen FPLCA
Kami melakukan analisis rangkai-gen pada Famili 1 dengan lima penanda mikrosatelit yang mencakup 5-13.1-q11.2 dan menguatkan ini sebagai lokus FPLCA. Alel terkait-penyakit diapit oleh D5S2021 dan D5S407 dengan skor LOD maksimum 4,8 untuk penanda mikrosatelit D5S418 (Tabel 1). Batas interval ini pada lengan pendek kromosom 5 ditentukan oleh rekombinasi antara D5S2021 dan D5S418 pada individu III-1, sedangkan batas lengan panjang kromosom 5 ditentukan dengan rekombinasi antara D5S1969 dan D5S407 pada individu IV-2 (berdasarkan asumsi bahwa rasuk-genetik dari kondisi ini sudah sempurna). Interval ~18 cM ini, yang melingkupi sentromer kromosom 5, mengandung lebih dari 150 gen dan pada gen-gen yang diprediksikan dengan komputer. Area ini melingkupi seluruh daerah rangkai-gen pada kromosom 5 yang dilaporkan sebelumnya, tetapi memperlebar interval rangkai-gen sebesar ~2,8 cM melewati batas pada lengan panjang kromosom. Dalam interval ini, kami mencari gen-gen yang mungkin memiliki relevansi patofisiologis terhadap gatal-gatal kulit. Kami berfokus pada gen-gen yang mengkdoekan reseptor interleukin (IL)-6, dengan catatan bahwa ekspresi IL-31 yang berlebihan pada mencit sebelumnya telah dibuktikan menyebabkan dermatitis dan sehingga oncostatin M (OSM) merupakan aktivator keratinosit kuat yang terlibat dalam inflamasi kulit. Dalam daerah-daerah terkait-gen yang kai temukan, terdapat empat reseptor tipe IL-6 yaitu: IL6ST, LIFR, IL31RA, dan ISMR (yang mengkodekan gp130, reseptor faktor inhibitory leukemia, reseptor IL-31, dan reseptor spesifik-ODM β, masing-masing). Dua dari gen ini, OSMR dan LIFR, juga terdapat dallam interval rangkai-gen orang-orang Taiwan yang telah diteliti. Sekuensing DNA genomik pada Famili 1 menunjukkan mutasi titik heterozigot pada OSMR, c.2072T → C (NM_003999) (Gambar 2A), yang terdapat pada semua individu yang terkena tetapi tidak pada individu yang tidak terkena. Mutasi ini mengubah isoleusin menjadi threonin pada asam amino 691 (p.1691T). Tidak ada mutasi yang ditemukan pada gen-gen kandidat yang lain. Selanjutnya kami mengurutkan gen OSMR dalam Famili 2 dan 3 dan menemukan mutasi missens heterozigot c.1853G → C (p.G618A) yang umum pada individu yang terkena dalam kedua keluarga yang diteliti (Gambar 2A). Analisis mikrosatelit selanjutnya di sekitar gen OSMR menandakan bahwa Famili 2 dan 3 kemungkinan memiliki nenek-moyang Britis yang sama. Baik mutasi missens p.1691T maupun p.G618A tidak ditemukan dalam screening terhadap 210 kromosom kontral yang dicocokkan dengan etnis kasus. Mutasi pada famili FPLCA terjadi dalam domain FNIII dari OSMRβ (Gambar 2B), tempat-tempat yang sebelumnya telah diketahui penting untuk fungsi reseptor dan transduksi sinyal. Disamping itu, asam amino-asam amino yang bermutasi ini terkonservasi dengan baik dalam proses evolusi (Gambar 2C).
Ekspresi dan Fungsi OSMRβ dalam FPLCA
OSMRβmerupakan sebuah komponen reseptor tipe II OSM dan reseptor IL-31 (Gambar 3). Salah satu ligannya, OSM, memiliki peranan dalam proliferasi sel, apoptosis, diferensiasi dan inflamasi, dan dalam keratinosit, OSM telah ditemukan memodulasi ekspresi beberapa gen yang terlibat dalam imunitas alami, angiogenesis, adhesi, motilitas sel, penataan ulang jaringan, regulasi siklus se, dan transkripsi. Pada reseptor tipe II OSM, OSMRβ bergabung dengan gp130, yang merupakan subunit reseptor paling umum dari reseptor sitokin tipe IL-6. OSM juga terikat ke reseptor tipe I OSM (LIFR dan gp130), walaupun LIFR jarang diekspresikan dalam keratinosit. Ligan lain untuk OSMRβ adalah IL-31, yang telah terbukti menginduksi pruritus parah pada model hewa. Dalam reseptor IL-31, OSMRβ bergabung dengan subunit reseptor IL-31 A. Famili IL-6 dari reseptor-reseptor sitokin lazimnya memicu pensinyalan melalui jalur-jalur Jak/STAT, MAPK, dan P13K/Akt.
Untuk menilai konsekuensi fungsional mutasi-mutasi OSMR, pertama-tama kami menilai tingkat ekspresi sitokin-sitokin tipe IL-6 relevan dalam mRNA dan reseptor-reseptornya pada sampel kulit subjek yang terkena dan pada sampel kontrol dan mengkulturkan keratinosit dengan teknik RT-PCR. Semua sitokin tipe IL-6 dan reseptor-reseptornya yang diteliti dideteksi dan diekspresikan dengan tingkat ekspresi yang mirip pada semua sampel. Selanjutnya, keratinosit yang dikulturkan FPLCA (dari Famili 2) distimulasi dengan OSM atau IL-31, dan kadar STAT terfosforilasi, Erk1/2, dan Akt diamati dengan Western blotting. Keratinosit kontrol normal merespons kuat terhadap OSM, dan juga teradap IL-31 sebagai telah dilaporkan sebelumnya. Akan tetapi, pada FPLCA, kadar pSTAT, pErk, dan pAkt berkurang ~65%-95% (sebagaimana dinilai dengan densitometer optik) setelah stimulasi OSM, dan tidak ada fosforilasi yang diamati setelah stimulasi IL-31 (Gambar 4, atas dan tengah). Respons terhadap OSM tergantung dosis pada keratinosit FPLCA dan keratinosit kontrol (Gambar 4, atas). Stimulasi dengan IL-6, yang tidak mencakup OSMRβ pada kompleks reseptornya, tidak menghasilkan perubahan fosforilasi dalam keratinosit FPLCA (Gambar 4, bawah).
Pembahasan
Penelitian ini telah mengidentifikasi bahwa mutasi-mutasi dalam reseptor OSMRβ menjadi dasar molekuer bagi FPLCA dan memberikan pengetahuan baru tentang mekanisme gatal dan apoptosis pada kulit manusia. Mutasi missens OSMRβ p.G618A terletak dalam domain FNIII kedua, dan p.1691T terjadi dalam domain FNIII pertama yang berdekatan dengan domain transmembran (Gambar 2B). Penelitian-penelitian in vitro sebelumnya terhadap penghapusan FNIII atau substitusi asam amino tunggal pada gp130 telah menunjukkan peranan-peranan penting untuk domain-domain ini dalam dimerisasi reseptor untuk homodier gp130 atau heterodimer gp130-LIFR. Karena OSMRβ memiliki pengaturan domani yang serupa dengan gp130, maka kami memprediksikan bahwa substitusi asam amino p.G618A dan p.1691T dalam daerah FNIII dari reseptor ini bisa mengganggu penggabungan reseptor normal antara OSMRβ dan gp130 serta OSMRβ dengan IL31RA. Ini kemudian mengarah pada penurunan aktivasi siyal oleh OSM dan IL-31 pada keratinosit FPLCA (Gambar 4 dan diilustrasikan secara sematis pada Gambar 5).
OSMRβ banyak diekspresikan pada banyak sel dan jaringan dan dengan demikian yang menjadi pertanyaan penting adalah mengapa mutasi-mutasi ini menghasilkan penyakit kulit? Sebagian dari penjelasan untuk mengapa mutasi missens manusia heterozigot menghasilkan FLPCA bisa dikaitkan dengan kurangnya reseptor tipe I OSM dalam keratinosit yang jika terdapat dalam jaringan lain, bisa mengimbangi reseptor tipe II OSM disfungsional. Kemungkinanlain bisa terkait dengan temuan terbaru tentang ekspresi gabungan OSMRβ dan IL-31RA dalam sel-sel kulit (tipe-tipe sel spesifik masih perlu ditentukan) serta neuron-neuron nociseptif pada ganglia akar dorsal yang terproyeksi kedalam dermis pada kulit. Sehingga, ada kemungkinan bahwa gambaran klinikopatologi FPLCA bisa hanya bermanifestasi pada tempat-tempat dimana tipe reseptor yang mengandung OSMRβ diekspresikan.
Mekanisme-mekanisme seluler pasti yang digunakan mutasi OSMRβ untuk menghasilkan pengurangan OSM dan pensinyalan IL-31, seperti pensinyalan yang terganggu melalui sebuah kompleks reseptor mutan atau degradasi OSMRβ mutan secara preamtur yang mengarah pada pengurangan jumlah OSMRβ yang tersedia untuk membentuk dimer dengan gp130 atau IL-31R selama aktivasi ligan, belum diketahui. Meskipun demikian, data kami mampu memberikan penjelasan untuk temuan histologis berupa peningkatan apoptosis keratinosit pada FLPCA. Kami menemukan penurunan aktivasi pensinyalan Jak/STAT, Erk1/2, dan PI3K/Akt, jalur-jalur yang telah dilaporkan memiliki efek antiapoptotik pada beberapa sel tumor. Dengan demikian, keratinosit-keratinosit dengan OSMRβ bermutasi bisa lebih peka terhadap apoptosis, yang menghasilkan kematian sel dan akumulasi material berkeratin dalam dermis superfisial. Saat ini belum diketahui apakah apoptosis serupa terjadi pada neuron-neuron nociseptif pada FPLCA, walaupun perubahan-perubahan degeneratif di beberapa saraf dalam dermis telah ditemukan pada mikroskop transmisi elektron.
Akan tetapi, bagaimana mutasi pada OSMRβ mengarah pada peningkatan gatal kulit masih memerlukan penelitian lanjut. Data terbaru kami menunjukkan penurunan pensinyalan pada keratinosit-keratinosit FPLCA setelah stimulasi dengan OSM atau IL-31, berbeda dengan laporan-laporan lain yang menandakna bahwa dermatitis gatal pada mencit disebabkan oleh ekspresi IL-31 yang berlebihan. Peranan ligan terkait OSMRβ lainnya, OSM, dalam neuron-neuron nociseptif belum diketahui dengan baik, walaupun telah diduga bahwa OS bisa memperlama nyeri selama inflamasi. Bagaimana mutasi gen OSMRβ bisa mempengaruhi fungsi neuron nociseptif masih belum jelas, tetapi jika hubungan bisa ditemukan, mekanisme ini bisa memiliki relevansi untuk menjelaskan konsep gatal neurologi pada kulit (“neurodermatitis”), yang sering menjadi pertimbangan klinis pada banyak pasien yang mengalami gatal kulit kronis. Dengan demikian, dengan pertmbangan FPLCA, gangguan ini bisa menjadi contoh pertama neurodermatitis sejati dan bukan gangguan primer pada keratinosit.
Penunjukkan mutasi-mutasi patogenik pada OSMRβ pada FPLCA sekarang memberikan peluang untuk mengeksplorasi apakah abnormalitas-abnormalitas pensinyalan melalui reseptor sitokin ini juga terdapat pada kasus-kasus PLCA sporadis serta mungkin pada dermatosis gatal yang didapat dengan pola-pola lichenoid pada inflamasi kult, seperti lichen planus atau penyakit graft-versus-host. Lebih daripada itu, dengan hubungan PLCA dengan berbagai jaringan konektif dan patologi autoimun, temuan kami bisa membantu memfokuskan penilaian respons pensinyalan IL-6 spesifik pada gangguan-gangguan yang umum ini. Penyelidikian seperti ini bisa mengarah pada target-target terapeutik baru untuk kondisi-kondisi ini serta untuk gejala-gejal dermatologi yang paling umum, yakni gatal.
Pendahuluan
Salah satu gejala yang paling umum dan paling sukar dipahami dalam dermatologi adalah kulit yang gatal (yang juga disebut sebagai pruritus). Sampai sekarang, masih relatif sedikit yang diketahui tentang mediator inti dalam terjadinya gatal-gatal, reseptor-reseptor, dan jalur-jalur, serta terapi efektif untuk menghindari gejala-gejala gatal masih terbatas. Salah satu gangguan kulit pruritus yang sering ditemukan oleh para dermatologist adalah amyloidosis kutaneous terlokalisasi primer (PLCA). Kondisi ini biasanya disertai dengan gatal-gatal (khususnya pada betis bawah) dan perubahan hiperpigmentasi dan penebalan kulit yang dapat terlihat (lichenifikasi) yang bisa diperburuk oleh penggarukan terus menerus. PLCA tidak terkait dengan bentuk amyloidosis sistemik lainnya; kulit pada PLCA menunjukkan degenerasi keratinosit basal fibrillary dengan peningkatan apoptosis, penggangguan serat-serat saraf yang tidak mengalami myelinasi, dan akumulasi melanosom dalam makrofage dermal dan sel-sel Schwann. Amyloid pada PLCA kemungkinan menunjukkan kombinasi filamen-filamen keratin, komponen amyloid P serum, dan deposisi sekunder imunoglobulin. Meskipun demikian, PLCA belum dilaporkan terjadi bersama dengan beberapa gangguan klinis lain seperti penyakit jaringan konektif (seperti lupus erythematosus sistemik, arthritis rheumatoid, skelrosis sistemik, skleroderma, sirosis hati primer, dan dermatomyositis) serta neoplasia endokrin ganda tipe 2A(MEN2A). PLCA pada beberapa individu yang mengalami MEN2A telah ditemukan terkait dengan substitusi asam amino spesifik dalam RET proto-oncogen (khususnya yang melibatkan kodon 634), tetapi tidk ada patologi gen RET yang telah ditemukan pada kasus PLCA tanpa adanya MED2A. Kebanyakan kasus klinis PLCA bersifat sporadis tetapi gangguan ini lebih umum pada beberapa daerah tertentu di dunia, termasuk Amerika Selatan dan Asia Tenggara, dimana sampai 10% kasus bisa diwariskan dalam keluarga (dominan autosomal). Akan tetapi, heterogeneitas genetik diduga karena scan genome-wide terbaru untuk PLCA familial (FPLCA) di Taiwan telah menunjukkan rangkai-genetika terhadap 1q23 atau 5p13. 1-q11.2 atau kemungkinan lokus yang tidak ditemukan lainnya, dengan skor LOD yang palign signifikan untuk lokus penyakit pada 5. Dengan demikian, pengidentifikasian gen untuk FPLCA bisa diharapkan memberikan pengetahuan baru tentang mekanisme patofisiologi tertentu yang mendasari gatal-gatal kulit, inflamasi, dan apoptosis keratinosit.
Dalam penelitian ini, kami memetakan sebuah keluarga Brazil dengan FPLCA pada 5p13.1-q11.2 dan melakukan analisis gen kandidat dengan mengurutkan DNA genomik. Kami menemukan mutasi missens dalam gen OSMR, yang mengkodekan OSMRβ, pada semua individu yang terkena dari keluarga FPLCA Brazil. Penyelidikan lebih lanjut pada dua keluarga kulit putih lainnya yang mengalami FPLCA (dari Inggris dan Afrika Selatan) juga menunjukkan mutasi pada OSMR. Abnormalitas-abnormalitas pada pensinyalan OSMRβ setelah stimulasi dengan ligan OSM dan IL-31 ditunjukkan, sehingga memberikan data faktual untuk mendukung mutasi gen OSMR yang bertanggung jawab untuk FPLCA serta menghasilkan data baru tentang mekanisme pruritus dan apoptosis keratinosit pada kulit manusia.
Bahan dan Metode
Sampel DNA, Analisis Mikrosatelit, dan Sekuensing
Setelah mendapatkan persetujuan Komite Etik dan setelah mendapatkan izin dari semua subjek, DNA genomik diekstraksi dari sampel-sampel darah perifer yang didapatkan dari tiga keluarga FPLCA (I-1; II-3 sampai 6; III-1, 3 sampai 6, 8 sampai 17; IV-2 sampai 4, 6 sampai 9 Famili 1; tiga individu yang terkena dari Famili 2, dan dua individu yang terkena dari Famili 3). DNA diamplifikasi dengan lima set primer untuk penanda-penanda mikrosatelit yang terletak antara 5p13,2 dan 5q11,2 (Tabel 1). Primer-primer ini didapatkan dari ABI PRISM Linkage Mapping Set Version 2.5 (Applied Biosystem). Produk-produk PCR dianalisis pada sekuenser ABI 310 DNA dengan Genescan 2.1 dan Genotyper 2.0 (Applied Biosystem). Skor LOD 2-poin dihitung dengan algoritma M-LINK LINKAGE versi 5.1 dengan asumpi frekuensi alel mutan 0,00001 dan 100% rasuk genetik (penetrance). Analisis gen kandidat selanjutnya dilakukan. Untuk sekuensing, sampel-sampel DNA diamplifikasi dengan primer-primer yang terletak dalam intron yang mengapit ekson individual dari gen OSMR dan IL31RA, IL6ST, dan gen LIFR. Produk PCR diurutkan dengan reagen ABI Big Dye Terminator (Applied Biosystem) pada sekuensi ABI 310.
RT-PCR
mRNA diekstraksi dari spesimen-spesimen biopsi kulit individu III-16 dalam Famili 1 dan salah satu individu yang terkena dari Famili 2 dan 3, masing-masing, serta sampel kulit normal, dengan menggunakan alat QIAGEN beserta sintesis cDNA selanjutnya dengan Superscript II reverse transkriptase (Invitrogen). Primer-primer yang memiliki target di dekat ujung-3' dari cDNA digunakan untuk mengamplifikasi reseptor sitokin Tipe IL-6 dan ligan-ligan yang bersangkutan.
Pengisolasian Keratinosit dan Kultur
Kultur-kultur keratinosit primer diisolasi menurut prosedur standar. Secara ringkas, setelah disosiasi mekanis, fragmen-fragmen biopsi kulit dicelupkan selama 1 jam pada 37oC dalam larutan trypsin-EDTA. Larutan ini selanjutnya disaring melalui strainer sel pori 100 μm (VWR), dan kemudian medium yang disuplementasi dengan 10% serum janin sapi (FBS) ditambahkan untuk menetralisir trypsin. Sel-sel diisolasi dengan sentrifus (5 menit, 1000 rpm), dan bulatan yang terbentuk disuspensi ulang dalam medium keratinosit normal. Terakhir, sel-sel dibuakkan dalam gelas kimia T25 yang mengandung feeders. Keratinosit-keratinosit dipertahankan pada medium DMEM:Ham F21 yang disuplementasi dengan FBS 10%, 5 μg/mL transferrin, 0,4 μg/mL hidrokortison, 10-20 toksin kolera, 10 ng/mL faktor pertumbuhan epidermal (EGF) 1,5 μg/mL insulin, dan 2 x 10-11 M liothyronin. Sel-sel feeder NIH 3T3 yang diperlakukan dengan mitomycin C segar ditambahkan ke keratinosit primer dua kali sepekan. Keratinosit yang keluar lebih awal dinonaktifkan dengan HPV16 (E6^E7), seperti dijelaskan sebelumnya dalam literatur.
Stimulasi Sitokin
Keratinosit dibiakkan dalam plat 6-wadah dan ditumbuhkan sampai bergabung. Sel-sel dipertahankan dalam medium keratinosit normal selama 3-5 hari setelah penggabungan. Sebelum stimulasi sitokin, sel-sel dicuci dua kali dalam larutan saline berbufer fosfat (PBS) dan diinkubasi dalam medium bebas serum (invitrogen) baik selama 2 atau 24 jam. Kultur-kultur kemudian distimulasi dengan sitokin yang relevan selama 15 menit sebelum preparasi hasil lysis untuk imunoblotting. Sitokin-sitokin yang digunakan dalam penelitian ini adalah OSM rekombinan, IL-6 dan IL-31. Konsentrasi sitokin yang digunakan adalah 10, 50, dan 100 ng/mL untuk OSM dan 100 ng/mL untuk IL-6 dan IL-31.
Immunoblotting
Sel-sel dicuci satu kali dengan PBS dingin dan dilysis dengan buffer RIPA yang mengandung anti protease. Hasil lysis sel diperlakukan dengan 4%-12% NuPAGE Novex Bis-Tris Gel (Invitrogen). Protein-protein yang terfraksionasi ditransfer ke membran transfer nitroselulosa Hybond-ECL (Amersham Bioscience). Membran dihambat dengan 5% milk-TTBS non-lemak selama 2 jam pada suhu ruangan dan diinkubasi selama satu malam pada 4oC dengan antibodi primer yang relevan. Kompleks antibodi-antigen divisualisasikan dengan kemiluminesensi tertingkatkan (Amersham Bioscience), menurut instruksi pabrik. Kepadatan optik dari berkas pada blot dihitung dengan Image J software. Antbodi-antibodi primer yang digunakan adalah STAT1(42H3)(9175), STAT3(124H6)(9139), STAT5(3H7)(9358), p44/42 MAP Kinase (Erk1/2)(9102), Akt (9272), phospho-STAT1-Tyr701(9171), phospho-STAT3-Tyr705 , (9131), phospho-STAT5-Tyr694(9351), phospho-p44/42 MAPK- Thr202/Tyr204 (phosphor-Erk1/2; 9106), phospho-Akt-Ser473
(9271) (Cell Signaling Technology, Inc.). Antiodi-antibodi sekunder adalah imunoglobulin/HRP anti-mencit dari kambing poliklonal dan imunoglobulin/HRP anti-kelinci dari babi poliklonal (Dako Cytomation).
Hasil
Gambaran klinis dan histopatologis FPLCA
Sebanyak 16 subjek dari empat generasi keturunan Brazil diketahui mengalami FPLCA, dengan pewarisan dominan autosomal (Gambar 1A). Pada individu yang terkena, gejala-gejala lazimnya bermula selama masa anak-anak disertai pruritus parah pada betis bawah, yang mengarah pada lichenifikasi kulit (Gambar 1B dan 1C). Histopatologi kulit lesi menunjukkan banyaknya pigmentasi dan material eosinofilik amorf dalam dermis papiler (Gambar 1D), yang menunjukkan hasil uji positif untuk tioflavin-T, yang konsisten dengan deposisi amyloid (Gambar 1E). Rincian-rincian kliniko-patologi Famili 2 (Britis kulit putih) dan famili 3 (Afrika selatan kulit putih) dengan FPLCA dominan-autosomal tela dilaporkan sebelumnya.
Identifikasi OSMR sebagai Gen FPLCA
Kami melakukan analisis rangkai-gen pada Famili 1 dengan lima penanda mikrosatelit yang mencakup 5-13.1-q11.2 dan menguatkan ini sebagai lokus FPLCA. Alel terkait-penyakit diapit oleh D5S2021 dan D5S407 dengan skor LOD maksimum 4,8 untuk penanda mikrosatelit D5S418 (Tabel 1). Batas interval ini pada lengan pendek kromosom 5 ditentukan oleh rekombinasi antara D5S2021 dan D5S418 pada individu III-1, sedangkan batas lengan panjang kromosom 5 ditentukan dengan rekombinasi antara D5S1969 dan D5S407 pada individu IV-2 (berdasarkan asumsi bahwa rasuk-genetik dari kondisi ini sudah sempurna). Interval ~18 cM ini, yang melingkupi sentromer kromosom 5, mengandung lebih dari 150 gen dan pada gen-gen yang diprediksikan dengan komputer. Area ini melingkupi seluruh daerah rangkai-gen pada kromosom 5 yang dilaporkan sebelumnya, tetapi memperlebar interval rangkai-gen sebesar ~2,8 cM melewati batas pada lengan panjang kromosom. Dalam interval ini, kami mencari gen-gen yang mungkin memiliki relevansi patofisiologis terhadap gatal-gatal kulit. Kami berfokus pada gen-gen yang mengkdoekan reseptor interleukin (IL)-6, dengan catatan bahwa ekspresi IL-31 yang berlebihan pada mencit sebelumnya telah dibuktikan menyebabkan dermatitis dan sehingga oncostatin M (OSM) merupakan aktivator keratinosit kuat yang terlibat dalam inflamasi kulit. Dalam daerah-daerah terkait-gen yang kai temukan, terdapat empat reseptor tipe IL-6 yaitu: IL6ST, LIFR, IL31RA, dan ISMR (yang mengkodekan gp130, reseptor faktor inhibitory leukemia, reseptor IL-31, dan reseptor spesifik-ODM β, masing-masing). Dua dari gen ini, OSMR dan LIFR, juga terdapat dallam interval rangkai-gen orang-orang Taiwan yang telah diteliti. Sekuensing DNA genomik pada Famili 1 menunjukkan mutasi titik heterozigot pada OSMR, c.2072T → C (NM_003999) (Gambar 2A), yang terdapat pada semua individu yang terkena tetapi tidak pada individu yang tidak terkena. Mutasi ini mengubah isoleusin menjadi threonin pada asam amino 691 (p.1691T). Tidak ada mutasi yang ditemukan pada gen-gen kandidat yang lain. Selanjutnya kami mengurutkan gen OSMR dalam Famili 2 dan 3 dan menemukan mutasi missens heterozigot c.1853G → C (p.G618A) yang umum pada individu yang terkena dalam kedua keluarga yang diteliti (Gambar 2A). Analisis mikrosatelit selanjutnya di sekitar gen OSMR menandakan bahwa Famili 2 dan 3 kemungkinan memiliki nenek-moyang Britis yang sama. Baik mutasi missens p.1691T maupun p.G618A tidak ditemukan dalam screening terhadap 210 kromosom kontral yang dicocokkan dengan etnis kasus. Mutasi pada famili FPLCA terjadi dalam domain FNIII dari OSMRβ (Gambar 2B), tempat-tempat yang sebelumnya telah diketahui penting untuk fungsi reseptor dan transduksi sinyal. Disamping itu, asam amino-asam amino yang bermutasi ini terkonservasi dengan baik dalam proses evolusi (Gambar 2C).
Ekspresi dan Fungsi OSMRβ dalam FPLCA
OSMRβmerupakan sebuah komponen reseptor tipe II OSM dan reseptor IL-31 (Gambar 3). Salah satu ligannya, OSM, memiliki peranan dalam proliferasi sel, apoptosis, diferensiasi dan inflamasi, dan dalam keratinosit, OSM telah ditemukan memodulasi ekspresi beberapa gen yang terlibat dalam imunitas alami, angiogenesis, adhesi, motilitas sel, penataan ulang jaringan, regulasi siklus se, dan transkripsi. Pada reseptor tipe II OSM, OSMRβ bergabung dengan gp130, yang merupakan subunit reseptor paling umum dari reseptor sitokin tipe IL-6. OSM juga terikat ke reseptor tipe I OSM (LIFR dan gp130), walaupun LIFR jarang diekspresikan dalam keratinosit. Ligan lain untuk OSMRβ adalah IL-31, yang telah terbukti menginduksi pruritus parah pada model hewa. Dalam reseptor IL-31, OSMRβ bergabung dengan subunit reseptor IL-31 A. Famili IL-6 dari reseptor-reseptor sitokin lazimnya memicu pensinyalan melalui jalur-jalur Jak/STAT, MAPK, dan P13K/Akt.
Untuk menilai konsekuensi fungsional mutasi-mutasi OSMR, pertama-tama kami menilai tingkat ekspresi sitokin-sitokin tipe IL-6 relevan dalam mRNA dan reseptor-reseptornya pada sampel kulit subjek yang terkena dan pada sampel kontrol dan mengkulturkan keratinosit dengan teknik RT-PCR. Semua sitokin tipe IL-6 dan reseptor-reseptornya yang diteliti dideteksi dan diekspresikan dengan tingkat ekspresi yang mirip pada semua sampel. Selanjutnya, keratinosit yang dikulturkan FPLCA (dari Famili 2) distimulasi dengan OSM atau IL-31, dan kadar STAT terfosforilasi, Erk1/2, dan Akt diamati dengan Western blotting. Keratinosit kontrol normal merespons kuat terhadap OSM, dan juga teradap IL-31 sebagai telah dilaporkan sebelumnya. Akan tetapi, pada FPLCA, kadar pSTAT, pErk, dan pAkt berkurang ~65%-95% (sebagaimana dinilai dengan densitometer optik) setelah stimulasi OSM, dan tidak ada fosforilasi yang diamati setelah stimulasi IL-31 (Gambar 4, atas dan tengah). Respons terhadap OSM tergantung dosis pada keratinosit FPLCA dan keratinosit kontrol (Gambar 4, atas). Stimulasi dengan IL-6, yang tidak mencakup OSMRβ pada kompleks reseptornya, tidak menghasilkan perubahan fosforilasi dalam keratinosit FPLCA (Gambar 4, bawah).
Pembahasan
Penelitian ini telah mengidentifikasi bahwa mutasi-mutasi dalam reseptor OSMRβ menjadi dasar molekuer bagi FPLCA dan memberikan pengetahuan baru tentang mekanisme gatal dan apoptosis pada kulit manusia. Mutasi missens OSMRβ p.G618A terletak dalam domain FNIII kedua, dan p.1691T terjadi dalam domain FNIII pertama yang berdekatan dengan domain transmembran (Gambar 2B). Penelitian-penelitian in vitro sebelumnya terhadap penghapusan FNIII atau substitusi asam amino tunggal pada gp130 telah menunjukkan peranan-peranan penting untuk domain-domain ini dalam dimerisasi reseptor untuk homodier gp130 atau heterodimer gp130-LIFR. Karena OSMRβ memiliki pengaturan domani yang serupa dengan gp130, maka kami memprediksikan bahwa substitusi asam amino p.G618A dan p.1691T dalam daerah FNIII dari reseptor ini bisa mengganggu penggabungan reseptor normal antara OSMRβ dan gp130 serta OSMRβ dengan IL31RA. Ini kemudian mengarah pada penurunan aktivasi siyal oleh OSM dan IL-31 pada keratinosit FPLCA (Gambar 4 dan diilustrasikan secara sematis pada Gambar 5).
OSMRβ banyak diekspresikan pada banyak sel dan jaringan dan dengan demikian yang menjadi pertanyaan penting adalah mengapa mutasi-mutasi ini menghasilkan penyakit kulit? Sebagian dari penjelasan untuk mengapa mutasi missens manusia heterozigot menghasilkan FLPCA bisa dikaitkan dengan kurangnya reseptor tipe I OSM dalam keratinosit yang jika terdapat dalam jaringan lain, bisa mengimbangi reseptor tipe II OSM disfungsional. Kemungkinanlain bisa terkait dengan temuan terbaru tentang ekspresi gabungan OSMRβ dan IL-31RA dalam sel-sel kulit (tipe-tipe sel spesifik masih perlu ditentukan) serta neuron-neuron nociseptif pada ganglia akar dorsal yang terproyeksi kedalam dermis pada kulit. Sehingga, ada kemungkinan bahwa gambaran klinikopatologi FPLCA bisa hanya bermanifestasi pada tempat-tempat dimana tipe reseptor yang mengandung OSMRβ diekspresikan.
Mekanisme-mekanisme seluler pasti yang digunakan mutasi OSMRβ untuk menghasilkan pengurangan OSM dan pensinyalan IL-31, seperti pensinyalan yang terganggu melalui sebuah kompleks reseptor mutan atau degradasi OSMRβ mutan secara preamtur yang mengarah pada pengurangan jumlah OSMRβ yang tersedia untuk membentuk dimer dengan gp130 atau IL-31R selama aktivasi ligan, belum diketahui. Meskipun demikian, data kami mampu memberikan penjelasan untuk temuan histologis berupa peningkatan apoptosis keratinosit pada FLPCA. Kami menemukan penurunan aktivasi pensinyalan Jak/STAT, Erk1/2, dan PI3K/Akt, jalur-jalur yang telah dilaporkan memiliki efek antiapoptotik pada beberapa sel tumor. Dengan demikian, keratinosit-keratinosit dengan OSMRβ bermutasi bisa lebih peka terhadap apoptosis, yang menghasilkan kematian sel dan akumulasi material berkeratin dalam dermis superfisial. Saat ini belum diketahui apakah apoptosis serupa terjadi pada neuron-neuron nociseptif pada FPLCA, walaupun perubahan-perubahan degeneratif di beberapa saraf dalam dermis telah ditemukan pada mikroskop transmisi elektron.
Akan tetapi, bagaimana mutasi pada OSMRβ mengarah pada peningkatan gatal kulit masih memerlukan penelitian lanjut. Data terbaru kami menunjukkan penurunan pensinyalan pada keratinosit-keratinosit FPLCA setelah stimulasi dengan OSM atau IL-31, berbeda dengan laporan-laporan lain yang menandakna bahwa dermatitis gatal pada mencit disebabkan oleh ekspresi IL-31 yang berlebihan. Peranan ligan terkait OSMRβ lainnya, OSM, dalam neuron-neuron nociseptif belum diketahui dengan baik, walaupun telah diduga bahwa OS bisa memperlama nyeri selama inflamasi. Bagaimana mutasi gen OSMRβ bisa mempengaruhi fungsi neuron nociseptif masih belum jelas, tetapi jika hubungan bisa ditemukan, mekanisme ini bisa memiliki relevansi untuk menjelaskan konsep gatal neurologi pada kulit (“neurodermatitis”), yang sering menjadi pertimbangan klinis pada banyak pasien yang mengalami gatal kulit kronis. Dengan demikian, dengan pertmbangan FPLCA, gangguan ini bisa menjadi contoh pertama neurodermatitis sejati dan bukan gangguan primer pada keratinosit.
Penunjukkan mutasi-mutasi patogenik pada OSMRβ pada FPLCA sekarang memberikan peluang untuk mengeksplorasi apakah abnormalitas-abnormalitas pensinyalan melalui reseptor sitokin ini juga terdapat pada kasus-kasus PLCA sporadis serta mungkin pada dermatosis gatal yang didapat dengan pola-pola lichenoid pada inflamasi kult, seperti lichen planus atau penyakit graft-versus-host. Lebih daripada itu, dengan hubungan PLCA dengan berbagai jaringan konektif dan patologi autoimun, temuan kami bisa membantu memfokuskan penilaian respons pensinyalan IL-6 spesifik pada gangguan-gangguan yang umum ini. Penyelidikian seperti ini bisa mengarah pada target-target terapeutik baru untuk kondisi-kondisi ini serta untuk gejala-gejal dermatologi yang paling umum, yakni gatal.
Comments
Post a Comment