Staphylococcus aureus resisten-methicillin (MRSA) yang mengandung gen leucocidin Panton-Valentine di Jerman pada tahun 2005 dan 2006

Thursday, November 19, 2009

Abstrak

Tujuan: Tujuan makalah ini adalah untuk mengkorelasikan antara staphylococcus aureus resisten-methicillin (MSRA) yang positif leucocidin Panton-Valentine (PVL) dengan lineage klonal menggunakan typing molekuler  dengan perujukan khusus terhadap isolat-isolat yang menunjukkan spa tipe 008/MLST (tipe sekuensi multi-lokus) ST8 (banyak terdapat di USA sebagai MRSA terkait-komunitas (caMRSA) USA300').

Metode: MRSA yang positif-PVL (n = 117) dideteksi diantara 4815 MRSA yang dikirim ke German National Reference Laboratory untuk pemeriksaan typing. Isolat-isolat ini dianalisis dengan PFGA, spa typing, typing sekuensi multilokus, pengelompokkan unsur-unsur SCCmec dan pendeteksian arcA, msr(A), mph(B) dan unit ulangan ≥6 AT dalam sekuensi SACOL0058 dengan menggunakan PCR.

Hasil: Diantara 117 isolat, 80 menunjukkan tipe spa t044 (cocok dengan MLST ST80) dan 23 menunjukkan tipe spa t008/MLST ST8. Tipe-tipe spa lainnya direpresentasikan secara sporadis. Karakterisasi lebih lanjut terhadap isolat-isolat yang menunjukkan t008/ST8 dengan teknik PCR [arcA, msr(A), mph(B) dan unit ulangan ≥6 AT] menandakan telah masuknya caMRSA 'USA300' di Eropa Tengah.

Kesimpulan: caMRSA ST80 masih dominan; akan tetapi, caMRSA ST8 yang menunjukkan karakteristik klon 'USA300' menjadi yang ke-dua paling umum. Pendeteksian rutin klon ini dalam bakteriologiklinis bisa dilakukan dengan mudah menggunakan PCR.

Kata kunci: MRSA komunitas, genotyping, penanda molekuler


Pendahuluan

Staphylococcus aureus yang resisten methicillin (MRSA) merupakan penyebab umum infeksi nosokomial di seluruh dunia. MRSA yang  terkait dengan rumah sakit (haMRSA) sering resisten terhadap banyak golongan antibiotik, sehingga membatasi pilihan pengobatan. Akan tetapi, sejak akhir tahun 1990an, infeksi MRSA dalam populasi umum yang tidak memiliki faktor risiko pasti untuk mendapatkan haMRSA telah dilaporkan, pertama kali di USA dan selanjutnya di berbagai daerah di dunia. MRSA yang terkait komunitas (caMRSA) biasanya tidak umum resisten terhadap antibiotik; sering mengandung gen lukS-PV lukF-PV yang mengkodekan lucocidin Panton-Valentine (PVL) dan unsur-unsur SCCmec dari tipe IV dan V. Kebanyakan haMRSA terkait dengan 8 atau 10 lineage klonal utama dari populasi S. aureus. caMRSA termasuk kedalam lineage klonal lainnya selain haMRSA. Akan tetapi, hanya sedikit diantaranya yang tersebar luas sehingga bisa dianggap epidemik. Di Amerika Serikat, dua turunan MRSA, yakni tipe sekuensi multilokus (MST) ST1 ('USA400' menurut pola PFGE) dan ST8 ('USA300'), merupakan caMRSA yang paling umum. Di Oceania, yang paling umum adalah ST30 dan di Eropa adalah ST80. caMRSA 'USA300' telah menjadi penyebab utama infeksi jaringan kulit dan jaringan halus di beberapa daerah di USA; juga ada laporan tentang infeksi terkait dengan perawatan kesehatan. Dengan demikian, pengidentifikasian klon ini secara tepat waktu di belahan dunia yang lain merupakan syarat penting untuk pencegahan penyebaran lebih lanjut.

caMRSA 'USA300' menunjukkan MLST ST8. Walaupun S. aureus peka-metichillin (MSSA) yang negatif-PVL dari turunan klonal ini masih umum dikalangan isolat-isolat S. aureus yang didapatkan dari infeksi dan kolonisasi, namun MRSA telah berkembang dari ST8 MSSA pada beberapa waktu dan pada beberapa kondisi dengan memperoleh elemen SCCme tipe I, II, dan IV. MRSA ST8 yang negatif-PVL, SCCmec IV, khususnya telah menjadi epidemik di rumah sakit-rumah sakit Irlandia. Pengidentifikasian caMRSA ST8 yang terpercaya tidak hanya memerlukan diskriminasi dari turunan caMRSA yang lain, tetapi juga diskriminasi dari MRSA, khususnya yang menunjukkan ST8.

Metode-metode typing molekuler tradisional untuk pendeteksian caMRSA ST8 mencakup pola-pola SmaI-makrorestriksi, typing sekuensi multilokus, typing sekuensi spa dan identifikasi lukS-PV lukF-PV dengan teknik PCR.

Jalur arginin deiminase tambahan yang dimuat oleh elemen kaset kromosomal yang berdekatan dengan  SCCmec IV kelihatannya spesifik untuk turunan caMRSA 'USA300'. Lebih lanjut, gen-gen resistensi makrolida yang terletak dalam plasmid, msr(A) dan mph(B), yang mengkodekan efluks makrolida dan fsofotransferase makrolida, masing-masing, telah dilaporkan untuk 'USA300'. Gen-gen resistensi ini lebih sering pada staphylococcus yang negatif-koagulase dan sejauh ini cukup jarang diantara S. aureus. Sebuah ulangan AT signatur yang terdiri dari ≥6 AT di daerah sekitar tempat integrasi SCCmec telah dilaporkan sebagai karakteristik lain dari caMRSA 'USA300'.

Disini, kami melaporkan jenis-jenis caMRSA dari Jerman pada tahun 2005 dan 2006 dengan penekanan khusus pada caMRSA varian ST8.

Bahan dan metode

Asal-usul isolat-isolat S. aureus yang diteliti

The German National Reference untuk staphylococcus di Institut Robert Koch, Wernigerode Zbranch telah membentuk jaringan berdasarkan laboratorium-laboratorium mikrobiologi diagnostik yang mengirim isolat-isolat untuk typing, semuanya ada 145 laboratorium di seluruh Jerman. Isolat-isolat MRSA yang dianggap kemungkinan sebagai caMRSA telah dikumpulkan dan diajukan ke pusat referensi berdasarkan kriteria berikut: (1) berasal dari infeksi-infeksi yang didapatkan dalam komunitas tanpa adanya faktor risiko yang terkait dengan haMRSA; dan (2) MRSA dari infeksi yang didapat di rumah sakit (lebih dari 48 jam setelah dirujuk) apabila terkait dengan infeksi dalam pada kulit dan jaringan halus dan dari pneumonia nekrosis.

Semua isolat dibiakkan pada agar darah biri-biri dan dikonfirmasi dengan prosedur standar sebagaimana S. aureus.

Uji kepekaan antimikroba dilakukan dengan mikrodilusi kaldu menurut DIN 58940, Deutsches Institut fur Normung.

Typing molekuler

Untuk pola-pola SmaI-makrorestriksi, diikuti protokol HARMONY seperti dijelaskan oleh Murchan dkk. Pola-pola yang dihasilkan dianalisis dengan software Bionumerics untuk evaluasi keterkaitan dan pembuatan dendogram. Typing sekuensi multilokus dilakukan menurut Enright dkk., kecuali untuk penggunaan primer forward alternatif untuk amplimer tpi.

Typing sekuensi spa dilakukan menurut protokol standar Ridom Staph Type dan dengan menggunakan software Ridom Staph Type untuk penentuan tipe spa. Elemen-elemen SCCmec dari tipe I-V yang diidentifikasi dengan menggunakan kombinasi PCR berbeda, telah dijelaskan sebelumnya dalam literatur.

Eksperimen-eksperimen PCR

Prosedur-prosedur untuk ekstraksi DNA dan pendeteksian gen resistensi antibiotik mecA, erm(A), erm(B) dan erm(C) dengan PCR dilakukan menggunakan primer-primer dan kondisi-kondisi yang telah disebutkan sebelumnya dalam literatur. PCR untuk pendeteksian lukS-PV  lukF-PV dilakukan dengan menggunakan primer-primer seperti dijelaskan oleh Lina dkk. dan kondisi-kondisi yang telah disebutkan sebelumnya dalam literatur.

Untuk pendeteksian msr(A), kami menggunakan pasangan primer msr(A)-f 5'GAAGCACTTGAGCGTTCT (1687 – 1704 pada ABO13298) dan msr(A)-r 5'-CCTTGTATCGTGTGATGT (1887-1869), dan untuk pendeteksian mph(B), kami menggunakan primer mph(B)-f 5'-CATGGAGTAGAATGGGTT (2417 – 2434 pada ABO13298) dan mph(B)-r 5'-TGGACTTATTGTGGCTGC (2604 – 2587).

PCR untuk arcA dilakukan dengan menggunakan primer arcA-f 5'TCAAACTTTGAGAGATGA (169-188, lokus SAUSA300-0065 pada CP000255) dan arcA-r (346-329), skema siklus menurut Stommenger dkk. dan suhu pendinginan pada 50oC.

PCR untuk pendeteksian sekuensi SACOL0058 dan ulangan-ulangan AT nya dilakukan dengan menggunakan primer-primer dan skema siklus seperti yang disebutkan oleh Bonnstetter dkk., dengan pengecualian suhu pendinginan 55oC.

Hasil

caMRSA dari varian klonal berbeda dan infeksi yang ditimbulkan

Jumlah MRSA yang mengandung PVL, yang akan diteliti adalah 46 diantara 2497 (1,8%) pada tahun 2005 dan 71 diantara 2318 (3,1%) pada tahun 2006.

Data tentang asal-usul klinis dan hasil typing ditunjukkan pada Tabel 1. Hubungan dengan turunan klonal ditentukan berdasarkan tipe sekuensi spa dengan menggunakan algoritma BURP. Tipe sekuensi multilokus (MLST) ditentukan untuk isolat-isolat tipe spa t008 (ST8),  t437 (ST59) dan t305 (ST617). Infekso nosokomial kemungkinan terjadi hanya pada dua pasien. Isolat-isolat sebagian besar diambil dari infeksi mendalam pada jaringan halus dan kulit; akan tetapi, juga ada lima kasus pneumonia, dua diantaranya memiliki dampak yang fatal.

Diantara 117 isolat yang diselidiki, 80 (68%) adalah tipe spa t044 (menandakan CC80), 23 isolat (20%) adalah t008 (menandakan CC8) dan 2 isolat yang tidak diketahui tipe-nya ditemukan sebagai ST8. Varian klonal lainnya memiliki representasi sporadis. Selain tiga isolat yang menunjukkan tipe spa t002 dan mengandung SCCmec V, typing dengan PCR menunjukkan elemen SCCmec IV untuk semua isolat lain yang diselidiki. Isolat-isolat yang menunjukkan tipe spa t044 berasal dari berbagai area di Jerman. Kasus infeksi pertama dengan caMRSA tipe spa t008 ditemukan di bagian barat Jerman pada tahun 2005, dengan kasus-kasus lain yang terjadi di tempat lain pada tahun 2006. Kasus-kasus yang terkait dengan isolat-isolat tipe spa t130 terbatas pada bagian selatan Jerman di tahun 2005-2006.

Pasien dengan infeksi yang disebabkan caMRSA t008, PVL-positif, SCCmec IVa dan hubungannya dengan USA

Pada tahun 2005, seorang pasien yang mengalami abses kulit telah tinggal di USA selama beberapa bulan. Disamping itu, ada dua episode infeksi yang terkait dengan basis militer USA. Pada awal 2006, isolat caMRSA positif lukS-PV lukF-PV yang menunjukkan ST8, t008, SCCmec Iva dan positif untuk lukS-lukF didapatkan dari kultur darah dan sekreasi trakea dari seorang anak umur 2-bulan yang mengalami pneumonia parah. Keluarganya adalah staf militer USA. Penyelidikan lebih lanjut terhadap anggota-anggota keluarga menunjukkan MRSA yang menunjukkan karakteristik sama. Pada November/Desember 2006, lima anggota staf dari basis militer yang sama terkena abses kulit. Isolat-isolat yang diidentifikasi adalah ST8, positif-lukS-PV lukF-PV dan SCCmec IVA dan menunjukkan tipe-tipe pulsa seperti terlihat pada nomor 13 di Gambar 1. Tiga isolat adalah spa t008 dan dua adalah spa yang tidak dapat ditentukan tipenya.

Masuknya caMRSA t008 kedalam rumah sakit

Selama tahun 2005, dua pasien di rumah sakit berbeda dijadwalkan untuk menjalani perawatan bedah akibat abses yang diderita. MRSA yang menunjukkan karakteristik sama, seperti yang diberikan sebelumnya, selanjutnya diisolasi dari infeksi luka pasca-operasi dari pasien-pasien lain yang berada dalam ruang sama pada saat yang sama, sehingga menandakan bahwa penularan nosokomial telah terjadi.

Karakterisasi lebih lanjut isolat-isolat yang menunjukkan tipe spa t008/MLST ST8

Semua isolat (23 isolat) resisten terhadap oksasilin (MIC ≥ 4 mg/L) dan terhadap eritromisin. Tiga isolat juga resisten terhadap clindamycin dan mengandung erm(C) disamping msr(A) dan mph(B). Analisis PCR menandakan keberadaan keberadaan elemen SCCmec IVa.

Seperti ditunjukkan pada gambar 1, pola-pola SmaI-makrorestriksi dari MRSA t008/ST8 membentuk sebuah kelompok terpisah apabila dibandingkan dengan varian klonal utama haMRSA dan caMRSA. MRSA ST8, SCCmec VIa, PVL-positif menunjukkan pola-pola yang mirip satu sama lain, tetapi berbeda dengan MRSA yang negatif PVL sebanyak lebih dari tiga fragmen.

PCR untuk karakteristik penanda bagi caMRSA 'USA300'

Walaupun MRSA positif-PVL yang menunjukkan ST8 tetapi kekurangan karakteristik 'USA300' lainnya belum dilaporkan sejauh ini, namun pengidentifikasian cepat klon khusus ini dengan PCR sangat penting. Dengan demikian, kami menguji isolat-isolat varian klonal caMRSA lain serta isolat-isolat representatif dari varian klonal haMRSA untuk keberadaan arcA, msr(A), mph(B) dan ≥6 ulangan AT dalam sekuensi SACOL0058 (Tabel 2). Jumlah ≥6 ulangan AT dalam sekuensi SACVOL0058 kelihatannya merupakan karakteristik untuk S. aureus dari varian klonal ST8. PCR untuk gen arcA yang terkait ACME positif pada 21 dari 23 MRSA t008/ST8 positif-PVL, tetapi juga untuk 3 dari 12 MRSA varian klonal ini yang negatif PVL. Penanda ini tidak dideteksi pada isolat-isolat yang yang bergabung dengan varian klonal lain dari haMRSA dan caMRSA. Gen resistensi makrolida, msr(A) dan mph(B), belum ditemukan pada isolat-isolat yang berasal dari varian klonal lain terkecuali satu isolat MRSA dari varian ST5.

Pembahasan

Seperti dilaporkan dari negara-negara Eropa, caMRSA ST80 masih mendominasi diantara caMRSA yang positif PVL. caMRSA yang bergabung dengan varian klonal ST1, ST5, ST9, ST22, ST30 dan ST59 kurang sering, tetapi sebelumnya ditemukan di Jerman pada tahun 2005 dan juga dilaporkan dari negara-negara Eropa lain. caMRSA ST8 yang positif-PVL pertama, t008 ditemukan di Jerman pada awal 2005, dan 22 kasus lebih lanjut ditindaklanjuti sampai akhir tahun 2006. Menariknya, caMRSA ST8 sebelumnya telah dilaporkan dari Belanda pada tahun 2003.

Karena pola-pola karakteristik yang tipikal, tidak diragukan bahwa 23 MRSA ST8 positif-PVL adalah turunan dari caMRSA 'USA300', dan importasi dari USA kemungkinan terjadi. Akan tetapi, caMRSA ST8 yang positif-PVL sebelumnya telah dilaporkan dari negara-negara Eropa, khususnya Belgia, Denmark, Belanda dan Irlandia. Juga ada beberapa laporan tentang MRSA ST8 positif-PVL dari Jepang dan dari Hongkong. Walaupun kita harus mengasumsikan bahwa isolat-isolat ini juga mewakili 'USA300', namun evolusi independen MRSA dari varian ST8 yang mengandung lukS-PV lukF-PV tidak bisa dikeluarkan sebagaimana ditunjukkan oleh sebuah laporan dari Inggris tentang caMRSA dari varian klonal ini yang mengandung lukS-PV lukF-PV, SCCmec I dan dan determinan supernatigen sec dan tst. MSSA ST8 yang negatif-PVL tersebar luas dikalangan karier dalam komunitas. ST8 MRSA muncul di awal tahun 1970an, dan masih ada di rumah sakit Jerman (26 isolat nosokomial dan 3 isolat komunitas diantara 2318 MRSA yang dikirim ke laboratorium kami di tahun 2006).

Sampai sekarang, caMRSA ST8 kelihatan belum tersebar luas di EROPA. Ini bisa disebabkan oleh perbedaan kondisi predisposisi dikalangan komunitas di Eropa dan di USA, dimana hubungan antara ras kulit-putih dan infeksi jaringan-lunak yang disebabkan oleh caMRSA terjadi. Akan tetapi, alasan untuk hubungan ini tidak jelas, dan kemungkinan ada faktor pembaur yang tidak diperhitungkan (seperti status HIV).

Selain kelompok infeksi di basis militer USA dan dua kasus dimana transmisi nosokomial mungkin terjadi, 14 kasus lainnya bersifat sporadis. Transmisi intra-familial seperti dilaporkan sebelumnya dari USA dan dari Belanda ditemukan hanya pada satu kasus.

Meskipun demikian, pendeteksian dini dalam laboratorium bakteriologi klinis diperlukan dan merupakan persyaratan penting untuk mencegah penularan lebih lanjut. Ini bisa dicapai melalui pendeteksian gen penanda dengan PCR yang merupakan karakteristik untuk caMRSA 'USA300' seperti arcA dan msr(A). Walaupun tidak sering, tipe spa t008 bisa ditemukan pada isolat-isolat dari varian klonal lain dari kompleks klonal CC8. Selain itu, 2 dari 23 isolat MRSA ST8 positif-PVL yang disebutkan disini tidak dapat ditentukan tipenya dengan spa typing. Dengan demikian, PCR untuk ≥6 ulangan AT pada SACOL0058 bermanfaat untuk mengkonfirmasi pengkorelasian MRSA yang positif PVL dengan varian ST8. Pengamatan tentang beberapa isolat yang negatif arcA diantara MRSA ST8 yang positif PVL dan isolat positif-arcA diantara MRSA ST8 yang negatif PVL berarti bahwa penggunaan PCR untuk menyelidiki keberadaan msr(A) bermanfaat sebagai sebuah penanda indikator.

Akan tetapi, kita perlu berhati-hati ketika menggunakan penanda-penanda epidemiologi molekuler pada elemen-elemen genetika yang dapat ditransfer, seperti kejadian kehilangan atau akuisisi elemen-elemen ini oleh varian klonal lain, seperti arcA pada ST5-MRSA-SCCmec II dari USA, bisa menimbulkan kerancuan.

0 comments:

Post a Comment

BlueDEX Ads
 
Bloggerized by Blogger Template